[发明专利]一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法

说明书

一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，涉及病毒检测领域；包括以下步骤：(1)通过聚焦声能装置快速现场处理样品和提取样品核酸。该装置操作简单，3‑10min后，得到核酸液；(2)通过RPA恒温扩增技术实现现场快速恒温对样品核酸RT‑RPA反应。反应过程需要简单恒温装置，40℃‑42℃反应20‑40min得到扩增产物。(3)通过核酸胶体金试纸条对扩增产物进行分析。现场将扩增产物样品加到试纸条，室温条件下，直接肉眼判定结果，约需要10min可以判定结果。本发明特点是，方法简单，产业现场能够完成整个过程，无需大型设备，无需特殊温度条件，全部为试管和试纸条反应，用时不超过40分钟。

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法。

背景技术

鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus，SVCV)属水泡病毒属(Vesiculovirus)，是一种弹状病毒，主要流行于欧洲、中东和俄罗斯，近几年蔓延至美洲和亚洲。SVCV宿主范围非常广泛，四大淡水鱼类均能被感染，其中最易感的为鲤科鱼类，尤其仔鱼，一旦感染死亡率可达70％。它可以引起鱼类大规模暴发鲤春病毒血症(SVC)，是世界动物卫生组织(OIE)必须通报的动物疾病，也是《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》中的一类动物疫病，是淡水鱼养殖场重点防控疫病。为预防该病暴发，在目前无疫苗使用的情况下，因此需要精准而有简便的检测技术对鲤春病毒血症病毒进行定期检测。目前的常用的检测手段为实时荧光PCR技术，但其检测过程和检测周期长，需要复杂的检测设备，检测成本高，很难全面推广应用。

近几年新发展的重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymeraseamplification，RPA)是一种等温核酸扩增技术。该技术的显著特点是在接近室温(37-42℃)的条件下，10-40min就能完成扩增反应，具有操作简单、快速、准确、灵敏度高、特异性强、检测时间短、结果读取多元化、不需要专业的操作人员操作、不需要昂贵的精密仪器等特点。只需在室外使用简单的加温设备即可完成反应，可以真正实现使用便携式的方法快速进行核酸检测，是目前可用于POCT最方便快捷的核酸检测方法之一。

但是RPA技术受蛋白质干扰大，而且分离提取SVCV的RNA时造成该RNA不同程度的产量和质量的损失，在待测样本中SVCV的含量较低时，由于分离提取不当，使大部分的SVCV核酸不能通过聚合酶链式反应扩增，检出限高。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，能提高SVCV的核酸产量，降低裂解物的干扰，降低检出限，操作简便，可现场进行快速检测。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，包括以下步骤：

S1，取待测样本，加入释放剂，置于焦点区域并传输1-80MHz的聚焦声能装置中，3-10min后，得到核酸液；

S2，向核酸液中加入逆转录酶浓缩缓冲液、dNTP、随机引物、RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶，40℃-42℃反应20-40min，合成cDNA模板；

S3，通过cDNA模板建立RT-RPA反应体系，得到扩增产物；

S4，将扩增产物进行稀释5-10倍，并通过胶体金试纸条进行检测。

进一步地，步骤S1中，温度为40-60℃，释放剂的pH值为6-9。

进一步地，所述释放剂包括洗涤剂5-30％、缓冲液30-120mM、离液剂5-20M、螯合剂20-100mM；

所述缓冲液为HEPES、TRIS、MOPS、PIPES、SSC、MES和磷酸盐的一种或多种的组合物；