[发明专利]无同源性、多个长片段、高效零背景组装方法

权利要求书

1.无同源性、多个长片段、高效零背景组方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步、在整个环化质粒限制性内切酶NotI位点唯一处，添加一个B片段Yesatori，同时保证B片段左右有且刚好只两个NotI酶切位点，以便后续NotI单切自连去除B片段；

第二步、示例无同源性的A、B片段之间设计两条Primer 1/2引物，无同源性的B、C片段之间设计两条Primer 3/4引物以引物作为两个片段之间连接的桥梁，其它片段之间设计依次类推；

第三步、将所有片段共7个ABCDEFG，同每个片段接头处的一对引物共7对primer1-14，一同转入酵母感受态细胞，使用Sc-Trp缺色氨酸液体培养基进行30℃震荡培养两天；

第四步、提取培养两天的酵母质粒；

第五步、提取的酵母质粒转化大肠杆菌扩增；

第六步、PCR菌检、提取大肠杆菌质粒酶切验证，测序验证；

第七步、NotI单切正确的大肠杆菌质粒，凝胶电泳回收，去除B片段，T4 DNA连接酶自连处理后导入大肠杆菌37℃培养筛选，得到去除多余的B片段质粒，最后再抽提大肠杆菌中的质粒，测序验证以及酶切验证质粒的正确性。

2.根据权利要求1所述的无同源性、多个长片段、高效零背景组方法，其特征在于，所述提取酵母质粒的具体操作步骤如下:

步骤S1、取1-5mL酵母培养物，于12000rpm转速下离心1-3min，吸去上清；

步骤S2、酵母细胞壁的破除：向酵母菌体中加入470μL山梨醇Buffer，充分悬浮菌体，加入25μL酵母破壁霉和5μLβ-疏基乙醇，混匀后于30℃下处理1-2h，期间可颠倒离心管3-5次，然后在转速12000r/min条件下离心1-3min，弃去上清，收集沉淀，向沉淀中加入250μLYP1充分悬浮沉淀，吸取上清；

步骤S3、向离心管中加入350μL YP3，立即温和地上下翻转6-8次，混匀后，于转速12000r/min下离心10min，用移液器小心地将上清转移至另一个干净的离心管中；

步骤S4、将步骤S3中上清液加入吸附柱中，于室温条件下放置2min，于转速12000r/min下离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min后，弃除废液，将吸附柱放入收集管中，12000r/min转速离心2min后，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置3-5min，然后将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加5-200μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000r/min条件下离心1min，即得酵母质粒。