[发明专利]无同源性、多个长片段、高效零背景组装方法

说明书

本发明公开了无同源性、多个长片段、高效零背景组方法，包括以下步骤：先在整个环化质粒限制性内切酶Not I位点唯一处，添加一个B片段Yesator i，同时保证B片段左右有且刚好只两个Not I酶切位点，示例无同源性的A、B片段之间设计两条Pr imer 1/2引物，无同源性的B、C片段之间设计两条Pr imer 3/4引物以引物作为两个片段之间连接的桥梁；将所有片段共7个ABCDEFG，同每个片段接头处的一对引物共7对pr imer1‑14，一同转入酵母感受态细胞震荡培养两天；第四步、提取培养两天的酵母质粒；最后经过扩增、检测即得，本发明提供一种无同源性、多个长片段、高效零背景组方法，经过酵母组装、大肠杆菌筛选，即完成零背景克隆，无空载体产出，且相较于传统克隆方式节约大量时间。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体的，涉及无同源性、多个长片段、高效零背景组装方法。

背景技术

目前，由于基因片段之间无同源性，通常无法一次性将6个片段按次序依次连接成环，常规基因合成方法都是分段依次多步骤完成，所需要的轮次经理的步骤较多。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无同源性、多个长片段、高效零背景组方法装方法。

本发明需要解决的技术问题为：

现有技术中，由于基因片段之间无同源性，通常无法一次性将6个片段按次序依次连接成环，常规基因合成方法都是分段依次多步骤完成，所需要的轮次经理的步骤较多。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

无同源性、多个长片段、高效零背景组方法，包括以下步骤：

第一步、在整个环化质粒限制性内切酶NotI位点唯一处，添加一个B片段Yesatori，同时保证B片段左右有且刚好只两个NotI酶切位点，以便后续NotI单切自连去除B片段；

第二步、示例无同源性的A、B片段之间设计两条Primer 1/2引物，无同源性的B、C片段之间设计两条Primer 3/4引物以引物作为两个片段之间连接的桥梁，其它片段之间设计依次类推；

第三步、将所有片段共7个ABCDEFG，这些片段可以通过PCR扩增或者质粒酶切得到，同每个片段接头处的一对引物共7对primer1-14，一同转入酵母感受态细胞，使用Sc-Trp缺色氨酸液体培养基进行30℃震荡培养两天；

第四步、提取培养两天的酵母质粒；

第五步、提取的酵母质粒转化大肠杆菌扩增；

第六步、PCR菌检、提取大肠杆菌质粒酶切验证，测序验证；

第七步、NotI单切正确的大肠杆菌质粒，凝胶电泳回收，去除B片段，T4 DNA连接酶自连处理后导入大肠杆菌37℃培养筛选，得到去除多余的B片段质粒，最后再抽提大肠杆菌中的质粒，测序验证以及酶切验证质粒的正确性。

进一步地，所述提取酵母质粒的具体操作步骤如下:

步骤S1、取1-5mL酵母培养物，于12000rpm转速下离心1-3min，吸去上清；

步骤S2、酵母细胞壁的破除：向酵母菌体中加入470μL山梨醇Buffer，充分悬浮菌体，加入25μL酵母破壁霉和5μLβ-疏基乙醇，混匀后于30℃下处理1-2h，期间可颠倒离心管3-5次，然后在转速12000r/min条件下离心1-3min，弃去上清，收集沉淀，向沉淀中加入250μLYP1充分悬浮沉淀，吸取上清；

步骤S3、向离心管中加入350μL YP3，立即温和地上下翻转6-8次，混匀后，于转速12000r/min下离心10min，用移液器小心地将上清转移至另一个干净的离心管中；