[发明专利]一种藜麦下胚轴离体再生方法

说明书

本发明公开一种藜麦下胚轴离体再生体系，以藜麦下胚轴作为起始材料，经诱导可获得大量不定芽，可不受季节限制获得再生植株，为藜麦转基因提供技术支撑。本发明建立的藜麦离体再生方法为藜麦新品种创制、分子机理研究等提供技术保障，促进藜麦产业发展。

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养和生物技术领域，具体为藜麦下胚轴离体再生方法。

背景技术

藜麦(C.quinoa Wild,2n＝36)属苋科(Amaranthaceae)藜亚科(Chenopodioideae)藜属(Chenopodium)，一年生双子叶植物，其籽粒作为粮食，具有丰富的营养物质。有“粮食之母”之称的藜麦，在20世纪70年代被美国航空航天局选为太空主食(Giusti L.Elgenero Chenopodium en Argentina 1:Numeros decromosomas.Darwiniana,1970,16:98-105.)。在生物学上，藜麦表现出突出的抗逆性和适应性，具有优良的抗寒抗盐性，为明星抗逆植物(杨发荣,刘文瑜,黄杰,魏玉明,金茜.不同藜麦品种对盐胁迫的生理响应及耐盐性评价[J].草业学报,2017,26(12):77-88.)。面对全球生态系统的不断变化，藜麦将成为维护未来国家粮食安全的重要一员，发挥越来越重要的作用。随着人类对藜麦的不断研究，藜麦在遗传育种和分子生物学方面都有了一定的进展。但分子育种方面进展缓慢，严重制约藜麦新品种的创制和推广，成为藜麦推广和产业化进程上的绊脚石。

曹宁等建立了藜麦的快速繁殖体系(曹宁,高旭,丁延庆,程斌,陈天青,何庆才,张立异.藜麦组织培养快速繁殖体系建立研究[J].种子,2018,37(10):110-112，115.)。S.Eisa1等人第一次报针对藜麦愈伤组织和细胞培养产生的体细胞胚胎发生，建立了体外培养方案。下胚轴外植体在添加0.45uM 2,4-D改良的Murashige和Skoog(MS)培养基上，培养2周内诱导愈伤组织。将起源于下胚轴外植体的幼年藜麦愈伤组织转移到无生长素的MS培养基中，超过5％的体细胞胚胎发育成可移植的幼株。可见再生效率很低(Eisa,S.,Koyro,H.,Kogel,K.et al.Induction of somatic embryogenesis in cultured cellsof Chenopodium quinoa.Plant Cell Tiss Organ Cult 81,243-246(2005))。

Mohsen Hesami.等人利用下胚轴建立了再生方案，在黑暗条件下在MS培养基中获得种子萌发率最高。取生长一周无菌苗(子叶已经展开，图11)的0.5-1.0cm下胚轴在添加0.5mg/L 2,4-D和0.05mg/L BAP的MS基培养基上观察到最佳愈伤组织诱导率为93.33％。在添加1.0mg/L BAP，1.0mg/L KIN和0.2mg/L IBA的MS培养基上，再生频率为83.33％。(Development of a regeneration protocol through indirect organogenesis inChenopodium quinoa wild.Indo-Am.J.Agric.Vet.Sci.,2016.4(1):25-32.)

虽然使用BAP等多类型激素，但用于取材状态和大小的限制，效率仍然不高(见图12)，并且并未研究离体再生小植物的伸长、生根和移栽成苗阶段。尚未报道有效的藜麦离体再生体系。

20世纪转基因和基因编辑技术的迅速发展，分子育种在培育新品种方面发挥着日益重要的作用。实现分子育种的关键是高效稳定的遗传转化体系。但藜麦遗传转化困难，严重影响藜麦的深入研究，其中制约藜麦遗传转化的关键因素是缺乏藜麦的离体再生体系。

发明内容

为解决上述瓶颈，本发明旨在建立藜麦的高效稳定的离体再生体系。一方面本发明人开展以藜麦多种不同外植体的再生研究，结合再生不同步骤的研究探索实现了高效藜麦离体再生体系。本发明中发明人针对下胚轴外植体的离体再生研究，通过添加不同激素，培养步骤的不同处理等方法，旨在提高以藜麦下胚轴为外植体的再生体系效率，实现藜麦的高效离体再生。