[发明专利]一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法

说明书

本发明涉及多克隆抗体制备技术领域。本发明提供了一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，包含如下步骤：将仿刺参AjCYTB基因中非跨膜区域序列拼接后进行密码子优化并构建AjCYTB表达载体；将表达载体转化到感受态细胞中，经扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化，得到AjCYTB蛋白并用其对动物进行两次免疫，得到仿刺参AjCYTB多克隆抗体。本发明制备的AjCYTB多克隆抗体，具有高灵敏度和较高的效价，给仿刺参AjCYTB蛋白的检测提供了的优质抗体，为仿刺参抗体的制备提供了新的方法和研究方向，为促进仿刺参养殖业的发展发挥重要作用。

技术领域

本发明涉及多克隆抗体制备技术领域，尤其涉及一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法。

背景技术

细胞色素b(cytochromeb，CYTB)存在于线粒体中，与其他细胞色素一起参与线粒体的氧化磷酸化电子传递。近年来，研究人员通过转录水平表达分析，发现AjCYTB在仿刺参的11个发育阶段和幼参的体壁、体腔细胞、肠道和呼吸树组织中稳定表达；并且在细菌脂多糖(LPS)刺激前后，仿刺参多个发育阶段和幼参的四种组织中AjCYTB转录水平表达量无显著差异，为其作为内参基因的可行性提供了依据。

目前针对仿刺参AjCYTB蛋白水平的相关研究较少，尤其是对AjCYTB的抗体制备等研究目前还无相关研究报道，研究制备仿刺参AjCYTB的多克隆抗体，将为仿刺参内参基因的研究提供有力工具，进而为仿刺参的生物学研究提供实验支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，为仿刺参的生物学研究提供实验支持。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种仿刺参AjCYTB多克隆抗体的制备方法，包含如下步骤：

(1)将仿刺参AjCYTB基因中跨膜区域对应的序列删除，拼接剩余的非跨膜区域序列，得到拼接后的AjCYTB基因序列；

(2)对拼接后的AjCYTB基因序列进行密码子优化，得到的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；

(3)用密码子优化后的AjCYTB基因序列构建AjCYTB表达载体；

(4)将AjCYTB表达载体转化到感受态细胞中，依次经过扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化，得到AjCYTB蛋白；

(5)用AjCYTB蛋白对动物进行两次免疫，得到仿刺参AjCYTB多克隆抗体。

作为优选，所述表达载体为pCold II，所述感受态细胞为大肠杆菌BL21感受态菌体。

作为优选，所述蛋白纯化过程中利用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。

作为优选，所述动物为6～8周的昆明鼠。

作为优选，所述两次免疫的过程中第一次免疫时每只昆明鼠免疫量为AjCYTB蛋白15～25μg，第二次免疫在第一次免疫后的第21天进行，每只昆明鼠免疫量为AjCYTB蛋白15～25μg。

作为优选，所述两次免疫后收集血清，所述仿刺参AjCYTB多克隆抗体存在于血清中。

作为优选，所述收集血清在第一次免疫后的第35天进行。

作为优选，所述仿刺参AjCYTB多克隆抗体的效价为1：50000。