[发明专利]一种新城疫VII型弱毒株无血清全悬浮细胞培养的方法

说明书

本发明涉及细胞和生物制品领域，具体涉及一种新城疫VII型弱毒株无血清全悬浮细胞培养的方法。在本发明所述方法中，所用新城疫病毒的毒株为新城疫基因VII型强毒经F基因位点突变而致弱的毒株。本发明所述方法，采用无血清全悬浮细胞培养，不受种蛋供应不足或不可控因素影响；操作简单、制备病毒量大，病毒含量高，克服了病毒鸡胚培养因种蛋供应不足而影响病毒的繁殖导致疫苗生产停滞，从而影响市场疫苗的供应。

技术领域

本发明涉及细胞和生物制品领域，具体涉及一种新城疫弱毒株无血清全悬浮细胞培养的方法。

背景技术

新城疫是由病毒引起的一种高度接触性传染病，主要侵害鸡和其他禽类及野生鸟类，人也可以感染，主要表现为结膜炎。本病是鸡病中危害最严重的一种疫病，发病急、死亡率高，造成很大经济损失。现在我国各地普遍开展强制免疫接种以提高鸡群的免疫力减少疫病的发生。

新城疫病毒的培养目前大多仍采用鸡胚繁殖，操作过程复杂，包括种蛋的引进、码蛋、消毒、进入前孵化机孵化，接种前照蛋剔除光蛋和死蛋，接种病毒，接种后进入后孵化继续孵化繁殖病毒。接种后24小时内照蛋剔除死胚，以后每天照蛋取出死胚直至培养结束，将培养结束的活鸡胚放入冷库冷冻4小时以上，收获全部鸡胚病毒液，将收获的病毒液过滤去除大的杂质，离心、纯化，最后纯化好的病毒液即为制苗用病毒液，收获病毒液后的鸡胚需高压并进行无害化处理。这一过程消耗大量人力物力，制备时间长，成本高、易污染，费时费力，且病毒液收获量少，从而增加了制苗成本。

有文献或专利报道用鸡胚成纤维细胞培养新城疫病毒，但成本相比悬浮细胞毒要高，且制作原代细胞过程复杂，不太适合大规模培养。有报道用EB66细胞培养新城疫病毒，但EB66细胞购买成本较高，培养基为专属用培养基，在国内一时难以推广开来，且免疫效果不确定。有用鸭胚视网膜(AGE1细胞)悬浮细胞培养新城疫基因VII型病毒，但AGEI细胞对营养要求高，相比于BHK细胞成本要增加。近些年BHK-21悬浮细胞培养新城疫病毒的研究报道开始增多，大多为培养新城疫经典毒株(如Lasota株)，但未见用BHK无血清全悬浮细胞培养新城疫基因VII型弱毒株的文献或专利。

全悬浮细胞培养制备抗原已成疫苗行业的流行趋势，全悬浮细胞培养相比于转瓶培养和微载体悬浮培养等更加容易操作，减少了贴壁细胞的胰酶消化过程，细胞密度也远超过贴壁细胞的量，更加容易放大培养增加病毒的繁殖量，减少细胞污染的机会，从而也节省了大量的人力、物力和财力。

禽类病毒异源细胞的全悬浮培养国内外早有研究，但真正用于生产的还很少，大多正处在研究阶段，这与病毒对异源细胞的适应性有关，不同病毒对异源细胞的适应性不同，很多禽类病毒不能在异源细胞上生长繁殖或者还没有被发现或者方法不对有待开发。鸡新城疫病毒的全悬浮细胞培养近几年有不少文献和专利报道，主要是针对新城疫病毒Lasota株的研究报道，Lasota株是较经典和常用的病毒株，但对悬浮细胞的适应性较弱。

发明内容

本发明的目的是针对引起免疫鸡群新城疫流行的基因VII型新城疫病毒制备生产基因VII型新城疫疫苗。

近年来，屡有发现免疫鸡群仍发生新城疫的流行，经实验室诊断确诊免疫鸡群流行的新城疫绝大多数属于基因VII型。基因VII型新城疫病毒与我国广泛使用的Lasota疫苗株之间存在明显遗传差异和抗原性差异，这是造成现行使用的疫苗免疫失败的原因，加速生产基因VII型新城疫疫苗势在必行。

第一方面，本发明提供一种新城疫弱毒株，所述新城疫弱毒株为新城疫VII型强毒经F基因位点突变而致弱的病毒株；所述F基因位点突变为毒株基因组的3161-3168位置的GCTTCAAC突变为GTTTAAAC。