[发明专利]一种特异性杀伤肿瘤细胞的免疫细胞制剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种特异性杀伤肿瘤细胞的免疫细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)制备针对PRAME抗原的DC呈递肽库；

(2)采集血液并分离单个核细胞；

(3)含特定呈递抗原肽的Mo-DC的培养；

(4)T细胞的培养；

(5)Mo-DC细胞和T细胞混合培养，获得针对PRAME抗原特异的DC-CTL免疫细胞制剂；

所述步骤(1)中的DC呈递肽库由在HLA-A*02:01配型免疫细胞靶向PRAME抗原时所呈递肽段中可溶性、亲和力和呈递能力均较高的4条肽段组成；

所述4条肽段的序列如SEQ ID NO.1～4所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的血液源自HLA-A*02:01患者的自身外周血液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的特定呈递抗原肽的序列如SEQ ID NO.1～4所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中培养的方法包括如下步骤：

1)将权利要求1步骤(2)中所述的细胞加入到淋巴细胞无血清培养基中进行培养，得到基础培养体系；

2)向步骤1)所述的基础培养体系中添加IL-4，GM-CSF因子诱导分化得到一次培养体系；

3)向步骤2)所述的一次培养体系中添加特定呈递抗原肽孵育，并加入TNF-α、IFN-γ刺激诱导得到含特定呈递抗原肽的Mo-DC。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述培养的时间为2小时，培养后需去除悬浮细胞。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述培养的条件为含500U/mLIL-4，800U/mL GM-CSF，5％HS的淋巴细胞无血清培养基，培养的时间为6天，每2天半量换液。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的特定呈递抗原肽的序列如SEQ ID NO.1～4所示。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的特定呈递抗原肽的浓度为10-50μg/mL。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述添加的时间为培养的第5天。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的TNF-α、IFN-γ的浓度分别为10ng/mL、100IU/mL。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中培养的方法包括如下步骤：

(1)在第6天，使用新鲜的外周血分离单个核细胞或直接使用权利要求1步骤(2)中制备得到的单个核细胞冻存复苏后加入到无血清培养基中，贴壁培养2小时后，取出悬浮细胞，得到T细胞基础培养体系；

(2)向步骤(1)所述的T细胞基础培养体系中添加IFN-γ、IL-7、IL-15。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述IFN-γ、IL-7、IL-15的浓度分别为1000U/mL、5ng/mL、5ng/mL。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中培养的方法包括如下步骤：

①用含5％HS、CD3、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-1α、特定呈递抗原肽的培养基培养Mo-DC和T细胞混合细胞；

②第9天，添加含5％HS和300U/mL IL-2的新鲜培养基；

③第11天开始，每2天添加含300U/mL IL-2的新鲜培养基，到第15～16天，获得足量针对PRAME抗原特异的DC-CTL免疫细胞制剂。