[发明专利]一种去除水体中ARGs的藻菌共生体系的构建方法

权利要求书

1.一种去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将普通小球藻细胞和地衣芽孢杆菌接种于已灭菌的150-200mL的BG11-LB培养基中；

S2：将接种了普通小球藻和地衣芽孢杆菌的混合培养基置于恒温、恒定光照的无菌室内培养；

S3：配制含有抗生素抗性基因质粒的人工污水；

S4：将步骤S2中混合培养基与步骤S3的人工污水混合，形成藻菌共生体系；

S5：取S4中的1-2mL藻菌混合液，采用细胞电穿孔法对取出的藻菌混合液进行细胞穿孔，冷却后重新置于步骤S4中的藻菌共生体系中，继续在恒温、恒定光照的无菌室内培养。

2.根据权利要求1所述的去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法，其特征在于，步骤S3中的含有抗生素抗性基因质粒的人工污水配置方法为：按N_ARGs＝C_质粒×6.05×10⁴/M_DNA计算质粒浓度，然后配置含有抗生素抗性基因质粒的人工污水；

其中，式中N_ARGs为人工污水初始抗生素抗性基因丰度，单位为copies/mL；

C_质粒为抗生素抗性基因质粒的浓度，单位为ng/mL；

M_DNA为抗生素抗性基因的DNA分子量。

3.根据权利要求1所述的去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法，其特征在于，步骤S5中采用细胞电穿孔法对取出的藻菌混合液进行细胞穿孔的具体步骤为：

S501：取S4中的1-2mL藻菌混合液置于无菌离心管，将离心管置于冰面，保持5min后，在4℃温度条件下离心后保留沉淀；

S502：向步骤S501的沉淀中加入1-2mL的cytomix缓冲液，在10000-12000g/min、0-4℃条件下离心2-5min，保留沉淀，重复此步骤3次；

S503：向5-10μL步骤S3人工污水中加入100-150μL质量分数为15-20％的蔗糖溶液作为细胞保护液，然后将细胞保护液加入到步骤S502中的沉淀中，并使用移液枪吹打；

S504：将步骤S503吹打后的溶液转移到预冷5-10min的电击杯中进行电机脉冲处理；

S505：将步骤S504中电击后的溶液冷却15-30min后，在8000-10000g/min、0-4℃条件下离心10-30s，保留沉淀，将沉淀重新置于步骤S4中的藻菌共生体系中，继续在恒温、恒定光照的无菌室内培养。

4.根据权利要求1所述的去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：

S101：将处于对数期的普通小球藻接种于灭菌的BG11培养基中，进行无菌培养，培养3-5代，藻细胞浓度达到1×10⁸cell/mL-9×10⁸cell/mL时用于藻菌共生体的培养；

S102：将处于对数生长期的地衣芽孢杆菌接种于灭菌的LB培养基中，置于无菌室进行光照培养，培养5-10代，菌细胞浓度达到1×10⁶CFU/mL-9×10⁶CFU/mL时用于藻菌共生体的培养；

S103：取1-5mL的普通小球藻和1-5mL的地衣芽孢杆菌，于无菌室内接种于150-200mL的BG11-LB培养基中，其中，BG11培养基与LB培养基按体积比1:1-1:5混合。

5.根据权利要求1所述的去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法，其特征在于，步骤S2和步骤S5中的恒温、恒定光照的温度设置为26-30℃，光照强度设置为120μmol/m²/s-150μmol/m²/s。

6.根据权利要求1所述的去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法，其特征在于，所述抗生素抗性基因选自sul1、sul2、tetM、tetQ、tetW中任意一种或任意组合。