[发明专利]一种去除水体中ARGs的藻菌共生体系的构建方法

说明书

本发明公开了一种去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法，包括以下步骤：S1：将普通小球藻细胞和地衣芽孢杆菌接种于已灭菌的BG11‑LB培养基中；S2：将接种了普通小球藻细胞和地衣芽孢杆菌细胞的混合培养基置于恒温、恒定光照的无菌室内培养；S3：配置含有抗生素抗性基因质粒的人工污；S4：将步骤S2中混合培养基与步骤S3的人工污水混合，形成藻菌共生体系；S5：取S4中的1‑2mL藻菌混合液，采用细胞电穿孔法对取出的藻菌混合液进行细胞穿孔，冷却后重新置于步骤S4中的藻菌共生体系中，继续在恒温、恒定光照的无菌室内培养。本发明中涉及的藻菌共生体对自然水体中的sul1、sul2、tetM、tetQ、tetW等ARGs具有良好的去除效果。

技术领域

本发明属于抗生素抗性基因污染处理技术领域，尤其涉及一种去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法。

背景技术

抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)污染已成为当今世界备受人们关注的水体污染问题。抗生素在医疗、畜牧、水产养殖业等领域的大量使用造成水体中ARGs污染在环境中的累积。据报道，我国众多水体中ARGs均有不同程度的检出，其中磺胺类和四环素类ARGs普遍存在且浓度较高。水体是ARGs释放和扩散的重要介质，ARGs可通过水循环进入人类食物链，对水体生态环境和人类健康构成严重威胁。因此，人们一直在积极探索水体中ARGs污染控制与修复的方法。

发明内容

为了克服现有的水体抗生素抗性基因污染物去除技术的缺陷，本发明提供了一种去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法，本发明中涉及的藻菌共生体对自然水体中的磺胺类抗生素抗性基因(sul1、sul2)、四环素类抗生素抗性基因(tetM、tetQ、tetW)等ARGs具有良好的去除效果。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种去除水体中抗生素抗性基因的藻菌共生体系的构建方法，包括以下步骤：

S1：将普通小球藻和地衣芽孢杆菌接种于已灭菌的150-200mL的BG11-LB培养基中；

S2：将接种了普通小球藻和地衣芽孢杆菌的混合培养基置于恒温、恒定光照的无菌室内培养；

S3：配制含有抗生素抗性基因质粒的人工污水；

S4：将步骤S2中混合培养基与步骤S3的人工污水混合，形成藻菌共生体系；

S5：取S4中的1-2mL藻菌混合液，采用细胞电穿孔法对取出的藻菌混合液进行细胞穿孔，冷却后重新置于步骤S4中的藻菌共生体系中，继续在恒温、恒定光照的无菌室内培养。

步骤S3中的含有抗生素抗性基因质粒的人工污水配置方法为：将构建好的目标抗生素抗性基因的质粒成品和人工污水初始抗生素抗性基因丰度按N_ARGs＝C_质粒×6.05×10⁴/M_DNA计算质粒浓度；使用步骤S2中的混合培养基配置所需ARGs种类与丰度的人工污水，计算抗生素抗性基因质粒浓度；

其中，式中N_ARGs为人工污水初始抗生素抗性基因丰度，初始ARGs丰度依据ARGs污染水平设置，单位为copies/mL；

C_质粒为抗生素抗性基因质粒的浓度，单位为ng/mL；

M_DNA为抗生素抗性基因的DNA分子量。

步骤S5中采用细胞电穿孔法对取出的藻菌混合液进行细胞穿孔的具体步骤为：

S501：取S4中的1-2mL藻菌混合液置于无菌离心管，迅速置于冰面，确保冰面覆盖离心管，保持5min后，在4℃温度条件下离心后保留沉淀；