[发明专利]一种快速、同时检测食品中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的方法

说明书

本发明提供了一种快速、同时检测食品中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的方法，以待检测食品样本为模板直接进行扩增，利用ddPCR同时检测食品中的大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌；待检测食品样本中菌液浓度换算公式为cfu/mL=copies/μL×20μL/加样量×1000μL。相比现有技术，本发明所述方法省略了DNA的提取步骤，直接以细菌为模板进行ddPCR检测，提高了食品中致病菌检测的效率；并且通过实验数据证实，直接加入完整的细菌而非提取的DNA也能够具有很强的抗干扰能力和极高的灵敏度。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，特别涉及一种快速、同时检测食品中大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的方法。

背景技术

微滴式数字聚合酶链式反应技术(droplet digital polymerase chainreaction,dd PCR)，又称为“第三代PCR技术”，是一种能够对目标核酸进行定性定量的新型检测方法。ddPCR技术可分为三个步骤：微滴的生成、微滴PCR扩增、微滴荧光信号判读。首先将带有荧光标记的样品反应体系进行稀释，通过液滴生成卡生成上万个油包水的微小液滴，每个液滴中至少包含一个待检核酸分子，或者不存在待检核酸分子；在PCR反应过程中，每一个微滴可以视为一个独立的反应体系进行PCR扩增，可以将待检核酸分子的信号值放大，PCR扩增结束后，利用微滴分析仪对每个微滴进行逐一检测，有荧光信号的判读为“1”，无荧光信号的判读为“0”，代表目标核酸的存在与否。最后，基于泊松分布原理和阳性微滴的比例，便可以计算出待检核酸分子的起始拷贝数，从而实现对原始反应体系中核酸靶分子数的绝对定量。

相比于传统的PCR技术和qPCR技术，ddPCR的检测不需要标准品，能够直接建立阳性微滴与原始浓度之间的函数关系，从而实现对目标核酸的绝对定量。与此同时，通过对样品的有限稀释和微滴化处理，能够有效降低背景DNA的干扰，提高检测的灵敏度和抗干扰性。

近年来，ddPCR的应用也在不断扩大，包括检测各类病原体、监测食品安全和水质、鉴别食源性成分掺假、转基因成分的检测和评估等等。在食源性致病菌检测领域，目前利用ddPCR技术进行检测的方法包括：细菌培养、设计特异性荧光PCR引物、人工污染食品样本、DNA提取与分离，以及ddPCR的检测等步骤。该方法需要从食品中提取致病菌DNA，在细菌DNA的提取过程中，会造成基因片段的断裂和部分基因的损失，不仅检测时间长、效率低，而且对于低浓度致病菌的检测，会影响检出结果的精确度；另外，该方法需要用高浓度的致病菌纯培养物人工污染食品样本，经过人工富集步骤后再提取DNA，无法直接对低浓度的污染样本直接进行取样。

因此，如何能够利用ddPCR技术快速、准确的检测食品中的致病菌，进一步提高检测精度，是目前急需解决的问题。

发明内容

为解决现有技术中的上述问题，本发明的目的在于简化ddPCR食源性致病菌的检测步骤、提高检测精度，提供一种快速、同时检测食品中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种快速、同时检测食品中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的方法，其中，以待检测食品样本为模板直接进行扩增，利用ddPCR同时检测食品中的大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌；

所述待检测食品样本为经过离心或浸泡处理后，提取获得的待测食品中的菌体样本；

待检测食品样本中菌液浓度换算公式为cfu/mL＝copies/μL×20μL/加样量×1000μL。

进一步的，所述ddPCR中的扩增体系为：

进一步的，对目标菌为大肠杆菌O157:H7的引物对为：