[发明专利]一种结核分枝杆菌整合型表达质粒及其应用

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌整合型表达质粒，所述的质粒包括如下结构元件：

(1)抗性基因的筛选标记，用于重组质粒的构建和筛选；所述的抗性基因为SacB和hyg抗性基因；

(2)分别位于抗性基因两侧的γδ序列，用于抗性进行敲除；所述的γδ序列如SEQ IDNO.33所示；

(3)用于目的基因插入及表达的元件；所述的用于目的基因插入及表达的元件为hsp60promoter；

(4)必要的标签元件，复制子以及结核分枝杆菌基因组整合元件；所述的标签元件为his标签，所述的复制子为oriE基因，所述的结核分枝杆菌基因组整合元件为attp和int基因；

所述的质粒为pTB01质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的结核分枝杆菌整合型表达质粒的如下应用：

(1)制备基因组中整合了特定过表达蛋白的结核分枝杆菌菌株；

或者(2)制备特定抗原含量较高的抗结核疫苗或预防结核疫苗；

所述菌株或者疫苗中含有特定目标蛋白高表达的结核分枝杆菌整合型表达质粒，所述特定目标蛋白高表达的结核分枝杆菌整合型表达质粒分别为：

包含Rv3899c蛋白的pBT01s1-Va07质粒，序列如SEQ ID NO.2所示；包含Rv0287蛋白的pBT01s1-Va16质粒，序列如SEQ ID NO.5所示；包含Rv3803c蛋白的pBT01s1-Va25质粒，序列如SEQ ID NO.8所示。

3.一种制备基因组中整合了过表达目标蛋白的结核分枝杆菌菌株的方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)将目标蛋白的表达基因插入到权利要求1所述的结核分枝杆菌整合型表达质粒中；

(2)扩增并提取该含有目标蛋白的结核分枝杆菌整合型表达质粒；

(3)将所述含有目标蛋白的结核分枝杆菌整合型表达质粒转入结核分枝杆菌中；

所述含有目标蛋白的结核分枝杆菌整合型表达质粒分别为：

包含Rv3899c蛋白的pBT01s1-Va07质粒，序列如SEQ ID NO.2所示；包含Rv0287蛋白的pBT01s1-Va16质粒，序列如SEQ ID NO.5所示；包含Rv3803c蛋白的pBT01s1-Va25质粒，序列如SEQ ID NO.8所示。

4.一种制备特定目标蛋白高含量的结核疫苗的方法，所述的方法包含如下步骤：

(1)将目标蛋白的表达基因插入到权利要求1所述的结核分枝杆菌整合型表达质粒中；

(2)扩增并提取该含有目标蛋白的结核分枝杆菌整合型表达质粒；

(3)将所述含有目标蛋白的结核分枝杆菌整合型表达质粒转入结核分枝杆菌中；

(4)以步骤(3)得到的结核分枝杆菌制备所述疫苗；

所述的含有目标蛋白的结核分枝杆菌整合型表达质粒分别为：

包含Rv3899c蛋白的pBT01s1-Va07质粒，序列如SEQ ID NO.2所示；包含Rv0287蛋白的pBT01s1-Va16质粒，序列如SEQ ID NO.5所示；

包含Rv3803c蛋白的pBT01s1-Va25质粒，序列如SEQ ID NO.8所示。

5.一组以权利要求1所述的结核分枝杆菌整合型表达质粒为基础载体制备得到的特定目标蛋白高表达的结核分枝杆菌整合型表达质粒，所述的特定目标蛋白高表达的结核分枝杆菌整合型表达质粒分别为：

包含Rv3899c蛋白的pBT01s1-Va07，序列如SEQ ID NO.2所示；

包含Rv0287蛋白的pBT01s1-Va16，序列如SEQ ID NO.5所示；

包含Rv3803c蛋白的pBT01s1-Va25，序列如SEQ ID NO.8所示。