[发明专利]一种结核分枝杆菌整合型表达质粒及其应用

说明书

本发明涉及一种结核分枝杆菌整合型表达质粒及其应用，所述的质粒包括如下结构元件：(1)抗性基因的筛选标记，用于重组质粒的构建和筛选；(2)分别位于抗性基因两侧的γδ序列，用于抗性进行敲除；(3)用于目的基因插入及表达的元件；(4)必要的标签元件，复制子元件以及结核分枝杆菌基因组整合元件。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的，涉及一种结核分枝杆菌整合型表达质粒及其应用。

背景技术

结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，结核病仍是严重威胁人类健康的传染病之一。BCG是唯 一被批准用于结核病预防的疫苗，但BCG对成人的保护效果不稳定，围绕重组分枝杆菌研发保护性疫苗 如重组BCG疫苗的研究一直是结核疫苗研究热点。

常规的通过在结核分枝杆菌基因组中整合特定的过表达蛋白，最终得到无抗型重组结核分枝杆菌效率 很低，重组菌的构建需要1年甚至更长时间。采用本方法构建整合型过表达重组分枝杆菌能够极大提高效 率，为加速分枝杆菌功能基因组的研究提供了新的遗传工具，为无抗且特定抗原含量较高的抗结核疫苗或 预防结核疫苗研发提供了极大的便利。

目前构建整合到基因组上的不含抗性的分枝杆菌的过表达菌株，需要的步骤大致如下：

(1)构建含抗性的整合型的过表达质粒；

(2)筛选构建成功的质粒后再转入分枝杆菌中；

(3)经过抗性和表达筛选获得含抗性基因的过表达菌株，

(4)构建敲除抗性质粒，构建敲除抗性噬菌体，获得不含抗性的分枝杆菌的过表达菌株。

可见，传统方法中，构建一个完整的基因过表达且抗性敲除的重组分枝杆菌菌株，至少要做4次质粒 构建，每一次构建都需要重复酶切和连接转化、筛选等繁琐步骤，此外，由于分枝杆菌生长缓慢的特性使 得这一过程常常需要1年甚至更长时间，导致传统方法效率极低，极大的限制了研究进程。

发明内容

本发明首先涉及一种结核分枝杆菌整合型表达质粒，所述的质粒包括如下结构元件：

(1)抗性基因的筛选标记，用于重组质粒的构建和筛选；

(2)分别位于抗性基因两侧的γδ序列，用于抗性进行敲除；

(3)用于目的基因插入及表达的元件；

(4)必要的标签元件，复制子元件以及结核分枝杆菌基因组整合元件。

所述的γδ序列如SEQ ID NO.33所示。

优选的，

所述的抗性基因为SacB和hyg抗性基因；

所述的用于目的基因插入及表达的元件为hsp60 promoter；

所述的标签元件为his标签，所述的复制子元件为用于在大肠杆菌中传代OIE复制子，所述的结核分 枝杆菌基因组整合元件为attp和int基因；

最优选的，

所述的质粒为pTB01质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还涉及所述的结核分枝杆菌整合型表达质粒的如下应用：

(1)制备基因组中整合了特定过表达蛋白的结核分枝杆菌菌株；

(2)制备特定抗原含量较高的抗结核疫苗或预防结核疫苗。

一种制备基因组中整合了过表达型目标蛋白的结核分枝杆菌菌株的方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)将目标蛋白的表达基因插入到所述的结核分枝杆菌整合型表达质粒中；