[发明专利]解除二价金属离子依赖的褐藻胶裂解酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体的说是一种解除二价金属离子依赖的褐藻胶裂解酶突变体及其应用。突变体为PL7家族褐藻胶裂解酶中酶解时以PolyG为特异性底物的褐藻胶裂解酶氨基酸序列中至少在与AlgAT5中的天冬氨酸D146位于同一三维结构位置上，或者是基于结构的多序列比对在D146位置上的氨基酸是天冬氨酸D或者谷氨酸E突变为带正电荷的氨基酸、甘氨酸、丙氨酸、颉氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。这些有益突变将会为褐藻胶裂解酶工业化开发和应用提供理论和技术支持，推动褐藻寡糖的绿色、高效制备。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体的说是一种解除二价金属离子依赖的褐藻胶裂解酶突变体及其应用。

背景技术

褐藻门是海洋巨藻中最重要的一个组成部分，不仅在海洋碳固定、海洋生态环境等生态价值方面具有重要意义，而且作为生物质资源同样具有重要的应用价值。属于褐藻门的巨藻很多，例如昆布(Laminaria hyperborean),大昆布(Macrocystis pyrifera),掌状海带(Lamimria digitata),泡叶藻(Ascophyllum nodosum),海带(Laminariajaponica),巨藻(Lessonia nigrescens),南极海藻(Durvillea antarctica)。褐藻中的主要成分是褐藻胶，根据生长部位、季节的不同含量最多能达到40％，其具体作用类似的看作是陆生植物体内的结构物质纤维素，褐藻胶在大型藻类中的主要生物学功能是起到结构支撑的作用，起到支撑稳定的作用。由于其亲水性、成凝胶、粘稠性以及生物相容性等独特的理化性质,多年来已广泛应用于食品、医药和化工等各个领域具有凝胶特性,作为稳定剂、增调剂和现化剂被广泛地应用于食品、纺织、印染、生物、医药等工业。例如作为膳食纤维的功能,起到控制血糖和血脂的功能、延缓衰老、抗肿瘤、增强机体免疫功能等多方面的生态效应和保健功能；由于其良好的生物相容性，褐藻胶还可以作基质材料将需要特殊位点释放的药物包裹起来,起到药物缓释的用途，另外也可作为生物支架材料,用于医学用途。

褐藻胶的结构是是由β-D-甘露糖醛酸(PolyM)和α-L-古罗糖醛酸(PolyG)两种糖单元通过1,4糖苷键聚合而成的线性大分子。褐藻多糖及其降解产物褐藻低聚糖已广泛应用于制药、食品、化工等多个领域。褐藻胶裂解酶能通过β-消去反应裂解褐藻胶的1,4糖苷键，在非还原性末端生成带有C4,5双键的不饱和糖醛酸。褐藻胶的高粘度和凝胶性能，被广泛用于食品行业作为食品改性剂。褐藻胶裂解酶通过β消除反应，断裂褐藻胶的1,4糖苷键，在非还原性末端生成带有C4,5双键的4-脱氧-L-erythro-hex-4-烯醇式吡喃糖醛酸。褐藻寡糖目前已经被证明具有刺激人的内皮细胞生长，以及促进巨噬细胞分泌细胞因子等诸多应用领域，已被广泛应用于制药、食品、化工、植保、动保等多个领域。褐藻胶被内切和外切褐藻胶酶转化为不饱和单糖，因此褐藻胶酶作为生物催化剂可以被用于可再生的化学品、生物燃料生产。褐藻胶作为长链大分子，通常是以褐藻酸盐的形式存在,常常跟金属离子形成褐藻酸盐，例如褐藻酸钠和褐藻酸钙等。其中两条PolyG链与一个二价金属离子形成“蛋盒”(egg box)结构，二价金属通常为钙离子。这种形式导致了其刚性更强，更不易被降解。

生物酶法降解褐藻胶生产褐藻寡糖具有绿色、高效、特异性强等特点。然而，目前已经报道的多种褐藻胶裂解酶都有明显的二价金属离子依耐性，当环境中存在金属螯合剂去除掉反应体系中的这些二价金属离子之后，酶的催化效率有十分明显的降低，例如以AlyPG为例，加入Zn²⁺和Mn²⁺之后与AlyPG野生型相比，酶活分提升为131％和175％，然而加入了EDTA鳌和掉二价金属离子之后，酶活降低为AlyPG野生型的17％。此外AlyA和AlyA1也同样具有这一特点。这一二价金属依赖性使得环境中必须得有金属离子的存在才可以发生催化反应，否则该反应无法进行。这一缺点会严重限制褐藻胶裂解酶的广泛使用。

发明内容

本发明目的在于提供一种解除二价金属离子依赖的褐藻胶裂解酶突变体及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：