[发明专利]高GC含量的核酸引物的后处理方法

说明书

本发明公开了高GC含量的核酸引物的后处理方法，通过将装有核酸引物的合成板装置配平后放入离心机离心，往合成板装置的每孔内加入二乙胺、乙腈混合液，静置后负压抽干，配平离心，再加入清洗乙腈，静置后负压抽干，配平离心，在合成板装置底部放置一块新的96微孔板，往合成板装置的每孔内加入氨解液，通过氨解盒夹具放于氨解盒中氨解，配平离心后弃去合成板装置，保留底部96微孔板，并在96微孔板的基础上加入氨解液，于氨解盒中氨解，在抽滤装置上放入合成板装置，加入乙腈溶剂静置后负压抽干，配平离心，加入三乙胺溶剂，静置后离心；该方法快速、高效地纯化高GC含量的核酸引物,相较传统洗脱法，该方法在得率方面提高了近2倍。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种高GC含量的核酸引物的后处理方法。

背景技术

引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3'-0H上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3'-0H，必须是游离的。目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法,该方法具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

合成引物是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2％)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

氨解反应是指含各种不同官能团的有机化合物在胺化剂的作用下生成胺类化合物的过程。氨解反应包括卤素的氨解、羰基化合物的氨解、磺基及硝基的氨解和直接氨解(其中胺化剂包括但不限于，液氨、氨水、尿素、铵盐)，主要原理是将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来，用胺化剂来裂解CPG连接化合物与初始核苷间的酯键，断裂下来的寡核苷酸带有自由的3'-羟基。脱保护基是用胺化剂处理较长时间以脱掉碱基环上的保护基团(其中包括氰乙基、苯甲酰基、异丙基)。

发明内容

为了克服上述的技术问题，本发明的目的在于提供了高GC含量的核酸引物的后处理方法：通过将装有核酸引物的合成板装置配平后放入离心机离心，在转速为2600r/min的条件下高速离心5s，然后往合成板装置的每孔内加入140μL的二乙胺、乙腈混合液，静置5min后负压抽干，配平高速离心，在转速为3200r/min的条件下离心1min,重复2次，然后再往合成板装置的每孔内加入200μL清洗乙腈，静置10s后负压抽干，配平高速离心，在转速为3200r/min的条件下离心1min，重复4次，然后在合成板装置底部放置一块新的96微孔板，往合成板装置的每孔内加入40μL氨解液，通过氨解盒夹具放于氨解盒中，在温度为40℃的条件下氨解1小时，然后配平，在转速为2400r/min的条件下高速离心1min后弃去合成板装置，保留底部96微孔板，并在96微孔板的基础上，加入50μL氨解液，通过氨解盒夹具放于氨解盒中，在温度为90℃的条件下氨解1小时，然后在抽滤装置上放入合成板装置，往合成板装置的每孔内加入200μL乙腈溶剂静置5s后负压抽干，重复2次，然后配平，在转速为2400r/min的条件下高速离心1min，然后往合成板装置的每孔内加入150μL的3wt％三乙胺溶剂，静置30s后，在转速为300r/min的条件下离心1min，之后在转速为600r/min的条件下离心1min，之后在转速为1000r/min的条件下离心30s，之后在转速为1500r/min的条件下离心30s，之后在转速为2000r/min的条件下离心30s，之后在转速为2400r/min的条件下离心30s，解决了传统洗脱法的收率低的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：