[发明专利]蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV miRFP670nano的构建方法及应用

权利要求书

1.蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV miRFP670nano的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)SnaBI-C38片段的克隆：以TBEV FL为模板，引物1和引物2为特异性引物，PCR扩增蜱传脑炎病毒SnaBI-C38片段；所述引物1和引物2的序列为：

引物1：

5’-TACGTATTAGTCATCGCTATTAC-3’；

引物2：

5’-CTCTCCGCTTCCCACGAGTCCATTTGGC-3’；

2)T2A和P2A序列与miRFP670nano基因的连接：将T2A序列和P2A序列设计在引物上，并分两轮PCR将T2A和P2A序列连接到miRFP670nano基因上；第一轮PCR：合成的基因miRFP670nano为模板，T2A miRFP670nano F1和P2A miRFP670nano R1为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带；进行第二轮PCR：第一轮PCR回收的目的条带为模板，T2AmiRFP670nano F2和P2A miRFP670nano R2为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带，将第二轮回收的目的条带连接到pGEM T载体上，命名为miRFP670nano 2*2A pGEM T；所述T2A miRFP670nano F1、P2A miRFP670nano R1、T2A miRFP670nano F2和P2AmiRFP670nano R2的序列为：

引物T2A miRFP670nano F1：

5’-CATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGGCAAACCTGGACAAG-3’；

引物P2A miRFP670nano R1：

5’-CTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCGCTCTGCTGGATGGCGATG-3’；

引物T2A miRFP670nano F2：

5’-GGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTC-3’；

引物P2A miRFP670nano R2：

5’-AGGTCCAGGGTTCTCCTCCACGTCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAG-3’；

3)T2A-miRFP670nano-P2A片段克隆：以miRFP670nano 2*2A pGEM T为模板，引物3和引物4为特异性引物，扩增出T2A-miRFP670nano-P2A片段；所述引物3和引物4的序列为：

引物3：

5’-CAAATGGACTCGTGGGAAGCGGAGAGGGCAGAG-3’；

引物4：

5’-CTTCCCGGCCATAGGTCCAGGGTTCTCCTC-3’；

4)C1-AflⅡ片段的克隆：以TBEV FL为模板，引物5和引物6为特异性引物，扩增出C1-AflⅡ片段；所述引物5和引物6的序列为：

引物5：

5’-GAACCCTGGACCTATGGCCGGGAAGGCCATTC-3’；

引物6：

5’-CTTAAGCAACACTCCAGTCTGG-3’；

5)构建SnaB I-C38-T2A-miRFP670nano-P2A-C1-AflⅡ片段：以引物1和引物6为特异性引物，步骤1)获得的SnaBI-C38片段、步骤3)获得的T2A-miRFP670nano-P2A片段和步骤4)获得的C1-AflⅡ片段为模板，通过重叠延伸PCR，将三个片段连接在一起，得到SnaB I-C38-T2A-miRFP670nano-P2A-C1-AflⅡ片段；

6)将扩增好的SnaB I-C38-T2A-miRFP670nano-P2A-C1-AflⅡ片段和TBEV的感染性克隆用SnaBI和AflⅡ双酶切，将酶切片段跑胶回收，再用T4连接酶进行连接，获得蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV miRFP670nano。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述蜱传脑炎病毒报告病毒TBEVmiRFP670nano的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。