[发明专利]蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV miRFP670nano的构建方法及应用

说明书

本发明公开了蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV miRFP670nano的构建方法及应用。本发明构建出了含有miRFP670nano报告基因的报告病毒，使可以通过检测miRFP670nano荧光蛋白信号来监测TBEV、研究病毒毒力，主要目的是为日后的TBEV的病毒示踪和活体成像做准备。

技术领域

本发明涉及蜱传脑炎病毒(TBEV)miRFP670nano报告病毒的构建，特别涉及稳定表达含有miRFP670nano荧光蛋白的报告病毒的构建及其应用。

背景技术

在中国，第一例人类蜱传脑炎(TBE)病例于1943年被发现。TBE在中国的分布与其蜱媒的分布密切相关。我国TBE病例均为远东亚型，由全沟硬蜱传播。内蒙古大兴安岭、黑海龙江小兴安岭、吉林省长白山林区是东北地区典型的TBE疫区。西北地区的新疆天山北坡林区和阿尔泰南坡林区也有间歇性的TBE报告。此外，TBE在云南(中国西南部)和西藏(中国西部)也有报道。

蜱传脑炎病毒(TBEV)是黄病毒蜱传类群中最重要的一种。TBEV有一个约11千碱基长的正链RNA基因组，基因组包括5'UTR和3'UTR以及一个开放阅读框(Open readingframe，ORF)，基因组总共编码3414个氨基酸，并翻译成单个多蛋白，该多蛋白经共转录和转录后加工成三种结构蛋白(Structural protein，SP)和七种非结构蛋白(Non-structuralprotein，nSP)。其中，结构蛋白有C、PrM和E蛋白，非结构蛋白有NS1、NS2A、 NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。相比于其他黄病毒尤其是蚊媒病毒，蜱传病毒研究相对较少，很多功能是基于其他黄病毒的研究推理出的。

miRFP670nano是最近从蓝藻色素中衍生出的近红外蛋白，可以用作内部蛋白质标签，有效结合内源性胆绿素并在各种哺乳动物细胞产生荧光，在体外和哺乳动物细胞中表现出高细胞亮度，对变性和降解还具有高度的稳定性。miRFP670nano的分子量只有17kda，是哺乳动物细胞中最小的单体近红外荧光蛋白，其亮度是目前最先进的双结构域近红外荧光蛋白的两倍。

发明内容

本发明的目的是构建出含有miRFP670nano荧光蛋白的蜱传脑炎病毒的报告病毒，使其可以在细胞中稳定表达，并且可以通过检测miRFP670nano荧光蛋白信号来研究病毒毒力，可作为抗病毒药物筛选的有力工具，为日后的TBEV的病毒示踪和活体成像做准备。

本发明采用的技术方案是：蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV miRFP670nano的构建方法，包括如下步骤：

1)SnaBI-C38片段的克隆：以TBEV FL为模板，引物1和引物2为特异性引物，PCR 扩增蜱传脑炎病毒SnaBI-C38片段；

引物1：5’-TACGTATTAGTCATCGCTATTAC-3’；

引物2：5’-CTCTCCGCTTCCCACGAGTCCATTTGGC-3’；

PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环，最后68℃延伸7min。

2)T2A和P2A序列与miRFP670nano基因的连接：将T2A序列和P2A序列设计在引物上，并分两轮PCR将T2A和P2A序列连接到miRFP670nano基因上。

第一轮PCR：合成的基因miRFP670nano为模板，T2A miRFP670nano F1和P2AmiRFP670nano R1为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带。

引物T2A miRFP670nano F1：

5’-CATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGGCAAACCTGGACAAG-3’；