[发明专利]一种DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法

权利要求书

1.一种DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）使用T4噬菌体β-葡糖基转移酶将尿嘧啶二磷酸葡萄糖的葡萄糖基团转移至待检测DNA的5-羟甲基胞嘧啶上，形成含有β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶的双链DNA；

（b）使用AbasI酶特异性识别含有β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶的双链DNA，并在距β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶的3´侧11-13 碱基处进行切割，形成一个2-3碱基的3´突出末端；

（c）设计并合成Harpin探针，所述Harpin探针从5´端到3´端依次为茎区Ⅰ、环区、茎区Ⅱ、目标识别区，且Harpin探针序列的5´端修饰有磷酸基团，所述茎区Ⅰ与茎区Ⅱ互补配对，所述目标识别区与待检测DNA序列切割形成的3´突出末端序列互补；

（d）将所述Harpin探针与步骤（b）中形成含有3´突出末端的双链DNA在DNA连接酶的作用下进行连接反应；

（e）以步骤（d）所得的连接产物为模板进行聚合酶链式反应，并加入Taqman探针，实时检测荧光信号，根据预先测定的标准曲线确定待检测DNA中5-羟甲基胞嘧啶的含量。

2.根据权利要求1所述的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，所述Harpin探针的茎区为6-20个碱基序列。

3.根据权利要求1所述的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，所述Harpin探针的目标识别区为2-3个碱基序列。

4.根据权利要求1所述的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，所述DNA连接酶包括T4 DNA连接酶、SplintR DNA 连接酶、T3 DNA 连接酶、T7 DNA 连接酶、Taq DNA连接酶。

5.根据权利要求1所述的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，所述T4噬菌体β-葡糖基转移酶的反应条件为37℃孵育60 min；所述AbasI酶的反应条件为25℃孵育12h。

6.根据权利要求1所述的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，所述DNA连接酶为SplintR DNA 连接酶，将反应体系放入PCR仪中，于25℃孵育30 min进行连接反应。

7.根据权利要求1所述的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应采用实时定量PCR系统，反应程序为94℃下加热 2 min，然后进行45个热循环，其中，每个热循环为94℃、30 s；56℃、30 s；同步监测荧光信号。