[发明专利]一种DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法

说明书

本发明提供了一种DNA中5‑羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，本发明是基于AbasI酶特异性识别并切割含有5ghmC的双链DNA特性，结合连接‑聚合酶链式反应（PCR）反应建立5hmC的定量分析方法。AbasI酶能够识别双链DNA中的5ghmC，并能在距修饰的胞嘧啶3´侧11‑13碱基处进行切割，形成一个2‑3碱基的3´突出末端。酶切后的产物会与Harpin探针在SplintR连接酶的作用下进行连接，然后将连接产物作为模板进行PCR扩增，最后根据标准曲线图来定量实际样品中5hmC的含量。本发明样品处理步骤简单，对实验操作者及实验条件没有特殊要求。本发明的灵敏度高，选择性好，成本较低。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是涉及一种DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法。

背景技术

5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是重要的表观遗传修饰，它是由TET家族酶氧化5-甲基胞嘧啶（5mC）产生的。进一步的研究表明5hmC参与基因表达调控，它与胚胎发育、神经系统功能以及肿瘤研究高度相关。许多研究发现，在包括黑色素，恶性神经胶质瘤，肝癌等在内的肿瘤中缺乏5hmC表达，5hmC是疾病诊断和治疗的潜在标志物。因此，准确检测5hmC对揭示其功能和机理具有重要意义。

在早期研究中，研究者通过薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）或者质谱（MS）等仪器建立5hmC的分析方法。这些方法可以检测DNA样本中所有位点5hmC的总含量，但是不能确定DNA序列中5hmC的分布也无法确定特定位点5hmC的含量。

为了解决这一问题，高通量测序技术被用来研究5hmC在基因组DNA中的分布和定量。如氧化亚硫酸氢盐测序（oxBS-Seq）和TET辅助亚硫酸氢盐测序（TAB-Seq）。在亚硫酸氢盐测序方法（BS-Seq）中，亚硫酸氢盐处理DNA并测序后，胞嘧啶（C）转变成胸腺嘧啶（T），5mC和5hmC表现为C。在氧化亚硫酸氢盐测序（oxBS-Seq）中，经过高钌酸钾（KRuO₄）氧化和亚硫酸氢盐处理DNA并测序后，C和5hmC转变成T，5mC表现为C。通过对比BS-Seq和oxBS-Seq结果，可以确定5hmC的分布和含量。TAB-seq通过使用β-葡萄糖基转移酶（β-GT）将葡萄糖转移到5hmC上，生成β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶（5ghmC），然后利用TET酶将5mC氧化为5-羧基胞嘧啶（5caC）。在经过糖基化转移酶、TET氧化酶和亚硫酸氢盐处理之后，在最终测序后，5mC会变为T，而5hmC会变为C。通过与未处理样品的BS-seq结果做对比，就可以确定5mC和5hmC的分布。这两种方法都可用于以在单碱基分辨率绘制5hmC分布并定量5hmC的相对丰度。高通量的测序方法非常耗时、并昂贵，适用于基因组DNA上大量的5hmC的分析。如果用高通量测序方法分析少量的特定位点5hmC的含量，显得浪费。

为了分析特定位点的5hmC的含量，需要发展步骤简单、灵敏度高、特异性好的特定位点的分析方法。

目前存在的特定位点5hmC的分析方法包括硼酸介导的聚合酶链式反应（PCR）分析方法，基于连接反应的滚环扩增方法，HpaII介导的连接-PCR法和过氧钨酸钾氧化介导的两相扩增系统（POM-TPAS）法。