[发明专利]一种基于便携式血糖仪的microRNA检测方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的基于便携式血糖仪的microRNA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将含有与靶标miRNA互补序列的发卡序列变性、复性形成发卡结构，分别将发卡结构与含有不同浓度靶标miRNA的样品孵育，孵育后加入核酸外切酶T，继续孵育得到反应混合物一；

所述的发卡结构的loop环状区包含多聚AMP序列；

S2、将S1步骤得到的反应混合物一与ATP生成系统混合孵育，得到反应混合物二；

所述的ATP生成系统中包含缓冲液、脱氧胞苷三磷酸、腺苷酸激酶、丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸；

S3、将S2步骤得到的反应混合物二与葡萄糖消耗/还原型辅酶Ⅱ荧光强度产生系统混合孵育，得到反应混合物三；

所述的葡萄糖消耗/还原型辅酶Ⅱ荧光强度产生系统中包含己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖和氧化型辅酶Ⅱ；

S4、对S3步骤得到的反应混合物三进行葡萄糖水平检测，得到葡萄糖水平值；对步骤S3得到的反应混合物三进行荧光检测，得到荧光强度；

S5、建立葡萄糖水平值与靶标miRNA浓度之间的关系曲线，以及荧光强度与靶标miRNA浓度之间的关系曲线；

S6、将实际待检测样品按照S1~S4步骤进行操作，测定出葡萄糖水平值，根据S5步骤葡萄糖水平值与靶标miRNA浓度之间的关系曲线，计算出待检测样品中的靶标miRNA含量；或将实际待检测样品按照S1~S4步骤进行操作，测定出荧光强度，根据S5步骤荧光强度与靶标miRNA浓度之间的关系曲线，计算出待检测样品中的靶标miRNA含量；

其中，所述的靶标miRNA为miRNA-21，发卡序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的miRNA-21的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，含有不同浓度靶标miRNA的样品中，还包括RNase抑制剂和Cutsmart缓冲液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的RNase抑制剂的浓度为8~12 U·μL^-1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的ATP生成系统中，缓冲液为10×Tris-HCl缓冲液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的ATP生成系统中，脱氧胞苷三磷酸的浓度为1~3 mmol·L^-1；腺苷酸激酶的浓度为0.4~0.6 U·μL^-1；丙酮酸激酶的浓度为3~5U·μL^-1；磷酸烯醇式丙酮酸的浓度为60~80 mmol·L^-1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖消耗/还原型辅酶Ⅱ荧光强度产生系统中，己糖激酶的浓度为3~5 U·μL^-1；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度为0.5~1.5U·μL^-1；葡萄糖的浓度为200~300 mmol·L^-1；氧化型辅酶Ⅱ的浓度为80~120 mmol·L^-1。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖水平值通过便携式血糖仪进行检测。