[发明专利]一种基于便携式血糖仪的microRNA检测方法

说明书

本发明公开了一种基于便携式血糖仪的microRNA检测方法。本发明设计了双功能发卡结构以识别靶标microRNA，并用作报告分子单磷酸腺苷的载体。与靶标miRNA杂交后，可通过核酸外切酶T特异性降解发卡结构，从而释放大量的AMP。然后，由四种酶和相应底物组成的智能信号转换机制通过酶级联反应产生双重输出信号。该机制包括两个部分：三磷酸腺苷生成系统和葡萄糖消耗/还原型辅酶Ⅱ产生系统。在前一步中产生的AMP触发了ATP的生成，随后转化成葡萄糖的消耗和NADPH的产生信号，这两种信号均与靶标miRNA的浓度成比例关系，并且可以分别通过常见的医用血糖仪(PGM)和荧光光谱仪测定，从而为microRNA的测定提供了一种便携式的检测方法。

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种基于便携式血糖仪的microRNA检测方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是由18-25个核苷酸组成的一种内源性非编码单链RNA。miRNA表达水平的变化与不同的病理状况和疾病(尤其是癌症)有关。例如，microRNA-21(miRNA-21)不仅是表达最高的miRNA之一，也在许多肿瘤的增殖和凋亡中起着至关重要的作用，包括肺癌，乳腺癌，胃癌，前列腺癌，结肠癌，脑癌，头颈癌，食道癌和胰腺癌。由于它们存在于几种常见的体液中，例如血清，血液，尿液，唾液和眼泪，miRNA的表达水平可作为肿瘤生物标志物用于疾病诊断或预后诊断。

由于miRNA的长度短且同源性高，使用传统的标准方法来实现miRNA检测是非常艰难的。到目前为止，已经报道了包括DNA芯片、Northern blot和实时荧光定量聚合酶链反应在内的标准检测方法，用于定量检测miRNA。但是，这些传统方法既费时，又需要昂贵的设备和熟练的技术人员，这限制了miRNA的便携式检测。最近，随着技术的不断方法，miRNA也发展出了很多新兴检测方法，比如电化学、共振光散射、侧向流动测定、基于锑的表面等离子体共振和表面增强拉曼光谱等新方法，但由于这些方法需要复杂的样品处理和实验操作，因此限制了在资源非常有限的环境中进行miRNA的检测，也限制了所报道的方法在即时检验(POCT)中的有效性。因此，迫切需要建立用于miRNA检测的快速便捷的便携式测定法。

目前，几种便携式检测方法和设备已被用于检测各种目标，例如通过手持式pH计检测黄曲霉毒素B1，基于智能手机的实时真菌毒素检测系统，基于纸张的策略和设备，以及基于PGM的检测。PGM是市场上最成功的POCT设备之一，事实证明它具有高便携性，低成本，简单操作和可靠的定量能力。2011年，有人首次报道了将转化酶和PGM结合起来检测非葡萄糖靶标。原理是转化酶可以水解蔗糖产生葡萄糖信号。从那时起，PGM被用于检测各种靶标，例如曲霉毒素A、Cd²⁺和黄曲霉毒素B1。但是，这些测定方法中的大多数都需要将转化酶与核酸序列耦合或使用纳米材料装载转化酶，转化酶的这种修饰很复杂，有时不可避免地会对转化酶的结构和活性产生负面影响。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明建立一种基于PGM设备和荧光光谱仪双信号输出，并利用四种酶进行级联酶反应放大的microRNA便携式定量检测。

本发明的第一个目的是提供了一种基于便携式血糖仪的microRNA检测方法，包括如下步骤：

S1、将含有与靶标miRNA互补序列的发卡序列变性、复性形成发卡结构，分别将发卡结构与含有不同浓度靶标miRNA的样品孵育，孵育后加入核酸外切酶T，继续孵育得到反应混合物一；

所述的发卡结构的loop环状区包含多聚AMP序列；

S2、将S1步骤得到的反应混合物一与ATP生成系统混合孵育，得到反应混合物二；

所述的ATP生成系统中包含缓冲液、脱氧胞苷三磷酸、腺苷酸激酶、丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸；

S3、将S2步骤得到的反应混合物二与葡萄糖消耗/还原型辅酶Ⅱ荧光强度产生系统混合孵育，得到反应混合物三；