[发明专利]蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A的构建方法及其应用

权利要求书

1.蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)SnaBI-C38片段的克隆：以TBEV FL为模板，引物1和引物2为特异性引物，PCR扩增蜱传脑炎病毒SnaBI-C38片段；所述引物1和引物2的序列为：

引物1：

5’-TACGTATTAGTCATCGCTATTAC-3’；

引物2：

5’-GTGTGAAGACCATCACGAGTCCATTTGGC-3’；

2)P2A序列和Nluc基因的连接：将P2A序列设计在引物上，并分两轮PCR将P2A序列连接到Nluc基因上；第一轮PCR：Nluc-pGEMT为模板，Nluc-F和P2A Nluc R1为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带；进行第二轮PCR：第一轮PCR回收的目的条带为模板，Nluc-F和P2A Nluc R2为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带；将第二轮PCR回收的目的条带连接到pGEM T载体上，命名为Nluc 2A pGEM T；所述引物Nluc-F、引物P2A Nluc R1和引物P2A Nluc R2的序列为：

引物Nluc-F：

5’-ATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；

引物P2A Nluc R1：

5’-CAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCCGCCAGAATGCGTTCGCAC-3’；

引物P2A Nluc R2：

5’-AGGTCCAGGGTTCTCCTCCACGTCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAG-3’；

3)Nluc-P2A片段的克隆：以Nluc 2A pGEM T为模板，引物3和引物4为特异性引物，扩增出Nluc-P2A片段；所述引物3和引物4的序列为：

引物3：

5’-CAAATGGACTCGTGATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；

引物4：

5’-CTTCCCGGCCATAGGTCCAGGGTTCTCCTC-3’；

4)C1-AflⅡ片段的克隆：以TBEV FL为模板，引物5和引物6为特异性引物，扩增出C1-AflⅡ片段；所述引物5和引物6的序列为：

引物5：

5’-GAACCCTGGACCTATGGCCGGGAAGGCCATTC-3’；

引物6：

5’-CTTAAGCAACACTCCAGTCTGG-3’；

5)构建SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段：以引物1和引物6为特异性引物，以步骤1)获得的SnaBI-C38片段、步骤3)获得的Nluc-P2A片段和步骤4)获得的C1-AflⅡ片段为模板，通过重叠延伸PCR，将三个片段连接在一起，得到SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段；

6)将SnaB I-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段和TBEV的感染性克隆用SnaBI和AflⅡ双酶切，将酶切片段跑胶回收，再用T4连接酶进行连接，获得蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc2A。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述蜱传脑炎病毒报告病毒TBEVNluc 2A的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1)SnaBI-C38片段的克隆中，PCR反应体系为：TBEV FL 1ul，引物1和引物2各1ul，KOD buffer 5ul，dNTP 5ul，MgSO₄3ul，KOD1ul，ddH₂O 33ul，总体系50ul；PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环，最后68℃延伸7min。