[发明专利]蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A的构建方法及其应用在审

专利信息
申请号: 202110234772.1 申请日: 2021-03-03
公开(公告)号: CN113005144A 公开(公告)日: 2021-06-22
发明(设计)人: 朱春玉;王旌羽;李辉;张学敏;高薇;胡媛媛 申请(专利权)人: 辽宁大学
主分类号: C12N15/85 分类号: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/40;C12N15/53;C12N7/01;C12Q1/70;C12Q1/66;C12R1/93
代理公司: 沈阳杰克知识产权代理有限公司 21207 代理人: 金春华
地址: 110000 辽宁*** 国省代码: 辽宁;21
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摘要:
搜索关键词: 脑炎 病毒 报告 tbev nluc 构建 方法 及其 应用
【说明书】:

发明公开了蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A的构建方法及其应用。本发明构建出了含有Nluc 2A报告基因的报告病毒,使可以通过检测Nluc荧光素酶信号来监测TBEV、研究病毒毒力,并且可作为抗病毒药物筛选的有力工具。

技术领域

本发明涉及蜱传脑炎病毒(TBEV)报告病毒的构建,特别涉及稳定表达含有Nluc荧光素酶的报告病毒的构建及其活性检测。

背景技术

在中国,第一例人类蜱传脑炎(TBE)病例于1943年被发现。TBE在中国的分布与其蜱媒的分布密切相关。我国TBE病例均为远东亚型,由全沟硬蜱传播。内蒙古大兴安岭、黑海龙江小兴安岭、吉林省长白山林区是东北地区典型的TBE疫区。西北地区的新疆天山北坡林区和阿尔泰南坡林区也有间歇性的TBE报告。此外,TBE在云南(中国西南部)和西藏(中国西部)也有报道。由于TBE在中国不是强制报告的传染病,缺乏对该病的监测,其发病率很可能被低估。并且该病有区域性、季节性、职业性等特征,因此增强我国对该病的检测和对TBEV的相关研究以达到对该病的控制是必要且可行的。

蜱传脑炎病毒(TBEV)是黄病毒蜱传类群中最重要的一种。TBEV有一个约11千碱基长的正链RNA基因组,基因组包括5'UTR和3'UTR以及一个开放阅读框(Open readingframe,ORF),基因组总共编码3414个氨基酸,并翻译成单个多蛋白,该多蛋白经共转录和转录后加工成三种结构蛋白(Structural protein,SP)和七种非结构蛋白(Non-structuralprotein,nSP)[21]。其中,结构蛋白有C、PrM和E蛋白,非结构蛋白有NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。相比于其他黄病毒尤其是蚊媒病毒,蜱传病毒研究相对较少,很多功能是基于其他黄病毒的研究推理出的。

Nluc是荧光素酶系统家族的最新成员,可用于生物发光应用,这种小荧光素酶是从深海虾中提取的,并经过人工优化的一种荧光素酶,它的底物是呋喃嗪。Nluc分子量较小,且该系统显示出比FLuc和RLuc高150倍以上的活性,发光输出保持稳定,持续时间比其他的荧光素酶长。因此,在几种荧光素酶中,Nluc基因在生物发光和报告基因的应用上都比其他荧光素酶更稳定、更灵敏。

发明内容

本发明的目的是构建出含有Nluc荧光素酶的蜱传脑炎病毒的报告病毒,使其可以在细胞中稳定表达,并且可以通过检测Nluc荧光素酶信号来研究病毒毒力,可作为抗病毒药物筛选的有力工具。

本发明采用的技术方案是:蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A的构建方法,包括如下步骤:

1)SnaBI-C38片段的克隆:以TBEV感染性克隆为模板,引物1和引物2为特异性引物,PCR扩增蜱传脑炎病毒SnaBI-C38片段;所述引物1和引物2的序列为:

引物1:5’-TACGTATTAGTCATCGCTATTAC-3’;

引物2:5’-GTGTGAAGACCATCACGAGTCCATTTGGC-3’;

PCR反应条件为:95℃预变性5min;98℃10s,58℃30s,68℃1min为一个循环,进行35个循环,最后68℃延伸7min。

2)P2A序列和Nluc基因的连接:将P2A序列设计在引物上,并分两轮PCR将P2A序列连接到Nluc基因上。

第一轮PCR:以Nluc-pGEMT为模板,Nluc-F和P2A Nluc R1为引物进行PCR,扩增好目的片段后,回收目的条带。

引物Nluc-F:

5’-ATGGTCTTCACACTCGAAG-3’;

引物P2A Nluc R1:

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