[发明专利]一种提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞、细胞库及制备方法

权利要求书

1.一种提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

比较腺病毒在细胞JH293和293T中的产毒效率；

从产毒效率高的JH293细胞中筛选多个单克隆细胞；

验证各单克隆细胞分别对腺病毒Ad11和腺病毒Ad5的产毒能力，得到分别对Ad11和Ad5产毒能力较高的单克隆细胞。

2.根据权利要求1所述的提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞的制备方法，其特征在于，从产毒效率高的JH293细胞中筛选多个单克隆细胞，具体步骤为：

将原始的JH293细胞进行培养，待长满时，分至细胞培养瓶进行培养；

细胞密度约70~80%时，弃上清，清洗，然后进行消化处理，将其分散成单个细胞；

加入完全培养基终止消化，然后离心处理；

弃上清，重悬细胞并用台盼蓝计数；

利用细胞培养基将细胞稀释后加入到孔板中进行培养；

在显微镜下观察孔板，将含有1个细胞的孔做标记；待做标记的细胞在孔内长满后，将其扩大培养至细胞培养瓶；

将扩大培养的细胞进行冻存保种。

3.根据权利要求1所述的提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞的制备方法，其特征在于，验证各单克隆细胞分别对腺病毒Ad11和腺病毒Ad5的产毒能力，包括以下步骤：

将单克隆细胞分别在孔板中铺板，然后分别感染相同MOI的腺病毒种子；

感染至细胞开始从皿底脱落时，感染Ad11的细胞在荧光显微镜下拍照，然后收集细胞和上清，放置于-78~ -82℃；感染Ad5的细胞直接收集细胞和上清，放置于-78~ -82℃；

将腺病毒经-78~ -82℃和35~38℃反复冻融，待用；

将腺病毒从-78~ -82℃取出，放置于35~38℃再次进行冻融，离心处理；

将腺病毒原液感染JH293细胞；

观察孔板内每浓度梯度的细胞内被感染的空斑数目；

计算其产毒能力，得到分别对Ad11和Ad5产毒能力较高的单克隆细胞。

4.一种如权利要求1~3任一所述的提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞的制备方法制备得到的JH293-Clone21细胞，其特征在于，将单克隆细胞分别在孔板中铺板，然后分别感染相同MOI的腺病毒Ad11种子。

5.一种如权利要求1~3任一所述的提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞的制备方法制备得到的JH293-Clone3细胞，其特征在于，将单克隆细胞分别在孔板中铺板，然后分别感染相同MOI的腺病毒Ad5种子。

6.一种提高腺病毒产毒能力的细胞库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将权利要求1~3中任一所述的提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞扩大培养并建立三级细胞库；

（2）对三级细胞库进行细菌、真菌、支原体、内毒素、染色体检定和核型分析。

7.根据权利要求6所述的提高腺病毒产毒能力的细胞库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将产毒能力比较高的JH293-Clone21细胞或JH293-Clone3细胞进行扩大培养；

待细胞足够时，弃上清，清洗，然后进行消化处理，将其分散成单个细胞；

在显微镜下观察消化至单个细胞后，加入完全培养基终止消化，然后离心处理；

弃上清，重悬细胞并用台盼蓝计数；

弃上清，用冻存液重悬，然后冻存管中加细胞悬液；

将冻存管冻存，作为种子库；

种子库中取出细胞，进行复苏扩增培养后，按上述方法冻存至少50支细胞作为主细胞库；

主细胞库中取出细胞，进行复苏扩增培养后，按上述方法冻存至少50支细胞作为工作细胞库。

8.根据权利要求6所述的提高腺病毒产毒能力的细胞库的制备方法，其特征在于，冻存步骤为：将冻存管放于程序降温冻存盒中，将程序降温冻存盒放置于-78~ -82℃，第二天转移至液氮罐中。