[发明专利]一种提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞、细胞库及制备方法

说明书

本发明适用于生物技术领域，提供了一种提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞、细胞库及制备方法。所述的提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞的制备方法，包括以下步骤：比较腺病毒在细胞JH293和293T中的产毒效率；从产毒效率高的JH293细胞中筛选多个单克隆细胞；验证各单克隆细胞分别对腺病毒11（Adenovirus 11,Ad11）和腺病毒5（Adenovirus 5,Ad5）的产毒能力，得到分别对Ad11和Ad5产毒能力较高的单克隆细胞。本发明改进现有腺病毒扩增所用细胞系，提高腺病毒生产效率，同时在GMP条件下建立了能够用于大规模腺病毒生产的三级细胞库。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞、细胞库及制备方法。

背景技术

腺病毒是一种非整合型双链DNA病毒，在自然界广泛分布。使用腺病毒载体用于基因治疗研究安全、对人无致病、致畸和致癌性，生物安全性高。且其可装载大片段外源基因，同时在分裂和不分裂细胞中均能被感染，而且感染宿主范围广。因此利用腺病毒作为基因治疗载体非常合适。

由于现有的可用于腺病毒复制的细胞一般为293细胞，是具有异质性的一群细胞组成的细胞系，而每个单克隆细胞的产毒能力并不一致，因而可能会导致整体的腺病毒产毒能力不高。

针对以上缺点，本发明将通过筛选293T细胞和JH293细胞的腺病毒产毒能力，然后对产毒能力高的JH293细胞进行单克隆筛选，从而筛选出具有较高产毒能力的单克隆细胞。不仅如此，本发明还在GMP（药品生产质量管理规范）条件下对筛选出的单克隆细胞株建立三级细胞库，以便用于后期大规模生产。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞、细胞库及制备方法，旨在解决背景技术中指出的现有技术存在的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）比较腺病毒在细胞JH293和293T中的产毒效率；

（2）从产毒效率高的JH293细胞中筛选多个单克隆细胞；

（3）验证各单克隆细胞分别对腺病毒Ad11和腺病毒Ad5的产毒能力，得到分别对Ad11和Ad5产毒能力较高的单克隆细胞。

作为本发明实施例的另一种优选方案，从产毒效率高的JH293细胞中筛选多个单克隆细胞，具体步骤为：

将原始的JH293细胞进行培养，待长满时，分至细胞培养瓶进行培养；

细胞密度约70~80%时，弃上清，清洗，然后进行消化处理，将其分散成单个细胞；

加入完全培养基终止消化，然后离心处理；

弃上清，重悬细胞并用台盼蓝计数；

利用细胞培养基将细胞稀释后加入到孔板中进行培养；

在显微镜下观察孔板，将含有1个细胞的孔做标记；待做标记的细胞在孔内长满后，将其扩大培养至细胞培养瓶；

将扩大培养的细胞进行冻存保种。

作为本发明实施例的另一种优选方案，验证各单克隆细胞分别对腺病毒Ad11和腺病毒Ad5的产毒能力，包括以下步骤：

将单克隆细胞分别在孔板中铺板，然后分别感染相同MOI的腺病毒种子；

感染至细胞开始从皿底脱落时，感染Ad11的细胞在荧光显微镜下拍照，然后收集细胞和上清，放置于-78~ -82℃；感染Ad5的细胞直接收集细胞和上清，放置于-78~ -82℃；

将腺病毒经-78~ -82℃和35~38℃反复冻融，待用；

将腺病毒从-78~ -82℃取出，放置于35~38℃再次进行冻融，离心处理；

将腺病毒原液感染JH293细胞；

观察孔板内每浓度梯度的细胞内被感染的空斑数目；