[发明专利]一种同时测定血浆中抗凝药物及活性代谢物浓度的方法

权利要求书

1.一种同时测定血浆中抗凝药物及活性代谢物浓度的方法，其特征在于，所述抗凝药物分别为达比加群酯、利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班，所述活性代谢物为达比加群；采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过前处理的血浆中的抗凝药物及活性代谢物，通过超高效液相色谱将待测物与血浆基质分离，然后串联质谱进行同位素内标定量，以标准品峰面积与相应内标峰面积之比为Y轴，标准品浓度为X轴，绘制标准曲线，计算血浆中抗凝药物和活性代谢物的含量；

色谱条件如下：

固定相：色谱柱型号Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，3.5μm，2.1×100mm；

流动相：A相：0.01～0.2％的甲酸水溶液，B相：0.01～0.2％的甲酸乙腈溶液；采用流动相A和流动相B不同体积混合，进行梯度洗脱；

质谱条件如下：

在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测，正离子模式；毛细管电压4500V；离子源温度550℃；第一离子源气体，55psi；第二离子源气体，55psi；气帘气，35psi；

所述经过前处理的血浆按照以下方法制备：取血浆样品，向其中加入甲醇和混合内标工作液，涡旋后离心取上清液，氮吹至干燥，将干燥样品溶于0.001～1％甲酸甲醇溶液，离心，取上清液与纯水混合；

该方法的定量下限为0.1ng/mL-0.5ng/mL；

所述梯度洗脱过程如下：

在0～1分钟中，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变；1～4分钟中，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至20:80；在4-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由20:80匀速渐变至5:95；在4.5-6分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持5:95不变；在6-6.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至95:5；在6.1-8分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变；每个样品采集时间为8分钟。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱条件还包括：柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量：2μL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经过前处理的血浆按照以下方法制备：取血浆样品100μL于1.5mL离心管中，向其中加入890μL冰冷甲醇和1μg·mL^-1所述混合内标工作液10μL，涡旋后离心取上清液，氮吹至干燥，向干燥样品中加入100μL含0.001～1％甲酸甲醇溶液并超声复溶，离心取上清50μL，加入450μL纯水混匀，待进样分析。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合内标工作液中包含同位素内标物利伐沙班-氘4和达比加群-氘3。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利伐沙班-氘4为利伐沙班、依度沙班和阿哌沙班相对应的内标；所述达比加群-氘3为达比加群和达比加群酯相对应的内标。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述混合内标工作液按照以下方法制备：

精密称取内标达比加群-氘3和利伐沙班-氘4分别约1mg，用DMSO溶解，得浓度分别为1mg·mL^-1的内标贮备液，将一定体积的两种内标贮备液用适量甲醇稀释混合，得浓度为10μg·mL^-1的混合内标溶液，取100μL的10μg·mL^-1混合内标溶液，加入900μL甲醇溶液，混合均匀得1μg·mL^-1混合内标工作液，置于-20℃冰箱中贮存。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准品按照以下方法制备：取达比加群酯、利伐沙班、依度沙班、阿哌沙班和达比加群贮备液一定量，用甲醇稀释成为适当浓度的工作液，取100μL此工作液，加入900μL空白血浆，制成含达比加群酯、利伐沙班、依度沙班、阿哌沙班和达比加群浓度分别为0.1，0.5，1，2，5，10，50，100，200，500ng·mL^-1的所述标准品。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述空白血浆为不含抗凝药物及活性代谢物的空白血浆。