[发明专利]一种检测蜜蜂急性麻痹病毒的引物组和探针与应用及其检测方法

说明书

本发明涉及动物检疫技术领域。本发明提供了一组能够特异性检测蜜蜂急性麻痹病毒的实时荧光RT‑PCR的引物组和探针，并利用所述的引物组和探针对实时荧光RT‑PCR的反应体系和反应程序进行优化得到的非诊断目的的检测方法。本发明的检测方法具有以下优点：(1)灵敏度高：本方法检测限达到9.8拷贝/μL；(2)特异性强：对蜜蜂急性麻痹病毒的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病毒无交叉反应，且重复性好；(3)操作简单、快速：整个反应约50分钟即可完成；(4)本发明可用于非诊断目的的蜜蜂急性麻痹病毒的检测及其与其他蜜蜂病毒病的鉴别，对于保障我国养蜂业和维护自然生态的健康发展具有重要意义。

技术领域

本发明涉及动物检疫技术领域，尤其涉及一种检测蜜蜂急性麻痹病毒的引物组和探针与应用及其检测方法。

背景技术

蜜蜂急性麻痹病毒(Acute bee paralysis virus，ABPV)是Bailey等在进行蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus，CBPV)传染性试验时发现的，当时蜜蜂感染ABPV后很快就会死亡，而感染后者则能存活数天，存在明显的区别，目前该病在世界范围内广泛流行。ABPV主要感染西方蜜蜂，不同发育阶段的蜜蜂均能感染，蜜蜂被感染后很快会出现麻痹症状，无法飞行，然后1～2天后死亡。ABPV除了能感染西方蜜蜂外，还能感染巴西蜜蜂，且感染率可达100％，另外还可以感染多个熊蜂蜂种，对蜂类带来的危害不容小觑。ABPV一般情况下并不引起明显的发病症状，多数呈隐性感染，但是当和狄斯瓦螨协同感染时，可导致蜜蜂的大批死亡，而且瓦螨还是ABPV的传播媒介，病毒通过狄斯瓦螨吸食蜜蜂时进入到寄主体内的血淋巴中，然后在蜂群中迅速传播。

常见的动物疾病诊断技术包括临床诊断、显微镜形态学观察、免疫学的ELISA抗体检测技术和病原核酸检测技术。由于蜜蜂病毒病的隐性感染，典型的发病症状并不多见，无法通过临床症状进行诊断，而且一旦出现明显的症状，疫病已经无法控制。ELISA检测技术由于灵敏度高等优点多被用于抗体的检测，但是由于蜜蜂病毒间具有高度的基因同源性，如ABPV和以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysisvirus，IAPV)同源相似性达65％、ABPV和蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus，KBV)同源相似性达67％，容易发生交叉反应，特异性不强，使得这一技术无法用于检测蜜蜂病毒进一步推广应用。实时荧光PCR技术由于灵敏度高、特异性强、简捷、快速等优点，已成为病原体检测的首选方法。

目前，针对ABPV的实时荧光PCR检测方法，现有技术报道的主要有Kukielka等建立的双重实时荧光RT-PCR方法，可以同时检测SBV和ABPV，但灵敏度只有389拷贝/μL；等建立的TaqMan探针RT-PCR，灵敏为44拷贝/μL；Kim等建立的巢式超快速PCR方法，整个扩增过程也需要将近1h左右，但灵敏度又有所降低，最低检测限只有100拷贝/μL。这样的灵敏度不能更准确的检测到蜜蜂的ABPV病毒。因此，现有技术中急需一种特异性更强，敏感度更高的检测蜜蜂ABPV的引物组和探针及其检测方法来弥补现有技术的不足，来保障我国养蜂业和自然生态的健康发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性更强，灵敏度更高的检测蜜蜂急性麻痹病毒的引物组和探针应用于检测ABPV，来保障我国养蜂业和自然生态的健康发展。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测蜜蜂急性麻痹病毒的引物组和探针，包括上游引物ABPV-F、下游引物ABPV-R及TaqMan探针ABPV-P；所述上游引物ABPV-F的序列如：SEQ ID NO.1所示；所述下游引物ABPV-R的序列如：SEQ ID NO.2所示；所述TaqMan探针ABPV-P的序列如：SEQ ID NO.3所示。

作为优选，所述TaqMan探针ABPV-P的5'端采用荧光基团ROX进行修饰，3'端采用BHQ1进行修饰。