[发明专利]一种纳豆激酶工程菌及提高纳豆激酶活力的方法

权利要求书

1.一种提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、分别提取枯草芽胞杆菌与纳豆芽胞杆菌的基因组DNA；

步骤二、以转录调控因子sinR和纳豆激酶编码基因aprN为目的基因，以枯草芽胞杆菌与纳豆芽胞杆菌的DNA为模板，分别设计第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，以得到sinR PCR产物和aprN PCR产物；

步骤三、以sinR PCR产物和aprN PCR产物构建串联sinR与aprN的重组质粒；

步骤四、将重组质粒转化枯草芽胞杆菌感受态细胞，以得到阳性克隆菌落；

步骤五、对阳性克隆菌落依次进行种子培养基培养和发酵培养。

2.根据权利要求1所述提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，所述第一引物对包括如SEQ ID No：3所示的第一上游引物和如SEQ ID No：4所示的第一下游引物；所述第二引物对包括如SEQ ID No：5所示的第二上游引物和如SEQ ID No：6所示的第二下游引物。

3.根据权利要求1所述提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，所述步骤三中构建串联sinR与aprN的重组质粒的方法包括如下步骤：

A1、采用BamHI和NotI对sinR PCR产物和载体pHT43-His进行双酶切，回收产物用T4连接酶连接得到重组质粒pHT-sinR；

A2、采用XbaI和SmaI对aprN PCR产物和重组质粒pHT-sinR进行双酶切，回收产物用T4连接酶连接得到重组质粒pHT-sinR-aprN。

4.根据权利要求3所述提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，所述步骤四中得到阳性克隆菌落的方法包括如下步骤：

B1、将重组质粒pHT-sinR-aprN加入E. coli DH5α感受态细胞中，以扩增质粒pHT-sinR-aprN；

B2、将质粒pHT-sinR-aprN利用电转化法转化B. subtilis 168感受态细胞后涂布于含氨苄青霉素抗性的平板上，经培养后得到BS168/pHT-sinR- aprN的阳性克隆菌落。

5.根据权利要求4所述提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，所述B1中扩增质粒pHT-sinR-aprN的方法是对加入重组质粒pHT-sinR-aprN的E. coli DH5α感受态细胞混匀后，先在冰浴上放置30 min，之后放入42℃循环水浴中热激90 s；然后转移至冰浴中冷却2-3 min后，加LB培养基37℃摇床温育45min，再取菌液涂布于氨苄青霉素的LB琼脂平板上，经37℃培养后，提取质粒。

6.根据权利要求4所述提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，所述B2中培养是在37℃恒温培养箱中培养12-16 h。