[发明专利]一种纳豆激酶工程菌及提高纳豆激酶活力的方法

说明书

本发明提供了一种纳豆激酶工程菌及提高纳豆激酶活力的方法，包括如下步骤：步骤一、分别提取枯草芽胞杆菌与纳豆芽胞杆菌的基因组DNA；步骤二、以转录调控因子sinR和纳豆激酶编码基因aprN为目的基因，以枯草芽胞杆菌与纳豆芽胞杆菌的DNA为模板，分别设计第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，以得到sinR PCR产物和aprN PCR产物；步骤三、以sinR PCR产物和aprN PCR产物构建串联sinR与aprN的重组质粒；步骤四、将重组质粒转化感受态细胞，以得到阳性克隆菌落；步骤五、对阳性克隆菌落依次进行种子培养基培养和发酵培养。本发明将群体感应调控因子与纳豆激酶编码基因串联表达，提高纳豆激酶含量及活力。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种纳豆激酶工程菌及提高纳豆激酶活力的方法。

背景技术

纳豆激酶类产品因具有非常强的溶解血栓的能力，具有非常广阔的应用价值。原因有三，其一，据柳叶刀等杂志报道，当前肆虐全球的新型冠状病毒引起的重型或危重型新冠肺炎（COVID-19）患者存在凝血功能异常。病毒感染机体后，攻击血管内皮细胞，致其损伤并诱发血管内弥漫性凝血，加之患者本身的基础疾病、激素使用等情况，极易形成血栓，进而导致全身器官衰竭危及生命。即使重症COVID-19患者经治疗恢复后，血管内弥漫存在的血栓同样会增加其静脉血栓栓塞症（VTE）的发生风险，留下长期的后遗症。其二，随着老龄化社会的到来，高血压、心肌梗塞、冠心病、脑溢血等血栓类疾病患者越来越多，且随着社会节奏加快和生活压力的增大该类疾病患者亦呈现年轻化趋势。其三，相较于其他纤溶酶，如组织型纤溶酶原激活剂、链激酶、尿激酶、蚓激酶和尿激酶型纤溶酶原激活剂等，纳豆激酶无抗原性、活性高、半衰期长、不引发出血、作用迅速直接，而且这种纤溶酶具有多种其他药理特性，如控制高血压、抗血小板和抗凝血特性、抗动脉粥样硬化和降脂活性等，因此成为国内外研究的热点。

这种用于治疗和预防血栓类疾病的纳豆激酶药物可以通过构建基因工程菌进行工业化生产，造福于血栓类疾病患者。目前常用的表达宿主有大肠杆菌、毕赤酵母和枯草芽胞杆菌。大肠杆菌细胞壁含有内毒素，分泌的蛋白常常会因掺杂该种物质对人畜造成伤害，且其目的蛋白常常形成包涵体，不利于目的产物的分离纯化与回收。毕赤酵母作为真核生物，生长速度较慢，且常用的甲醇诱导表达系统具有一定毒性，不能用于食品生产。而枯草芽胞杆菌被美国食品药品管理局（FDA）列为原则上认为安全的微生物(GRAS)，因此在保健品、食品领域中的具有远大的应用前景，这是大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统所不能及的。构建枯草芽胞杆菌系统进行纳豆激酶工业化生产，国内外已有文献报导。但是否可以通过改造群体感应系统调控因子达到纳豆激酶的高效合成未为可知，以及群体感应系统调控因子参与下，外源基因诱导表达体系的优化条件如何变化，也同样未为可知。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种纳豆激酶工程菌及提高纳豆激酶活力的方法，目的是实现改造群体感应调控因子，使纳豆激酶高效合成。

基于上述目的，本发明提供了一种提高纳豆激酶活力的方法，包括如下步骤：

步骤一、分别提取枯草芽胞杆菌与纳豆芽胞杆菌的基因组DNA；

步骤二、以转录调控因子sinR和纳豆激酶编码基因aprN为目的基因，以枯草芽胞杆菌与纳豆芽胞杆菌的DNA为模板，分别设计第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，以得到sinR PCR产物和aprN PCR产物；

步骤三、以sinR PCR产物和aprN PCR产物构建串联sinR与aprN的重组质粒；

步骤四、将重组质粒转化枯草芽胞杆菌感受态细胞，以得到阳性克隆菌落；