[发明专利]GII.17型诺如病毒全人源中和性单链抗体的制备及鉴定方法

权利要求书

1.一种GII.17型诺如病毒全人源中和性单链抗体的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

S1：构建全人源噬菌体单链抗体库；

具体是，采集GII.17NoV目标对象恢复期外周血，利用密度梯度离心法分离出PBMC，利用Trozil法提取PBMC的总RNA，逆转录合成cDNA；

设计合成人抗体基因的引物，并以cDNA为模板，扩增抗体重链可变区基因V_H和轻链可变区基因V_L，重叠延伸PCR拼接V_H和V_L形成scFv基因；

线性化噬菌粒载体pCANTAB-5E，构建重组质粒pCANTAB-5E-scFv，将重组质粒pCANTAB-5E-scFv电转化至E.coli TG1感受态细胞后加入辅助噬菌体M13K07培养，得到全人源噬菌体单链抗体库，并挑取抗体库中单克隆做菌液PCR且对阳性克隆进行测序分析；

S2：对全人源噬菌体单链抗体库进行淘筛及特异性鉴定；

具体是，以GII.17NoV P颗粒为固相抗原，对全人源噬菌体单链抗体库进行富集性筛选获得与GII.17NoV结合的噬菌体并扩增，得到特异性GII.17NoV噬菌体单链抗体库；

将特异性GII.17NoV噬菌体单链抗体库铺到氨苄抗性琼脂板上挑取单克隆，补加辅助噬菌体M13K07拯救，离心制备噬菌体上清，用Phage-ELISA鉴定噬菌体上清的特异性，并选取阳性克隆进行测序分析；

S3：制备GII.17NoV全人源单链抗体；

具体是，设计原核表达引物，以步骤S2所得阳性噬菌体上清的菌液为模板，扩增scFv片段，使用限制性内切酶BamH I和Not I双酶切载体pGEX-4T-1，并将scFv片段重组克隆至载体pGEX-4T-1上，将产物转化至E.coli T0P10感受态细胞中，挑取单克隆做菌液PCR，鉴定重组质粒是否插入目的片段，并对阳性克隆进行测序分析后提取获得pGEX-scFv重组质粒；

利用大肠杆菌表达系统表达pGEX-scFv重组质粒，然后用GST-resin亲和层析柱纯化，加入凝血酶去除融合蛋白GST-scFv的蛋白标签GST后获得scFv，即GII.17NoV全人源中和性单链抗体。

2.根据权利要求1所述的GII.17型诺如病毒全人源中和性单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤S1中GII.17型NoV目标对象恢复期外周血来自由GII.17NoV引起的急性胃肠炎暴发目标对象。

3.根据权利要求1所述的GII.17型诺如病毒全人源中和性单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤S1中人抗体基因的引物包括6对VH家族基因、用于连接抗体重轻链的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS的两条互补连接肽、12对VL家族基因以及Sfi I和Not I酶切位点的scFv上下游引物。

4.根据权利要求1所述的GII.17型诺如病毒全人源中和性单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤S1中构建重组质粒pCANTAB-5E-scFv的具体过程为，分别使用限制性内切酶Sfi I和Not I对scFv基因和噬菌粒载体pCANTAB-5E双酶切，然后用T4连接酶连接构建形成重组质粒pCANTAB-5E-scFv；

辅助噬菌体M13K07与E.coliTG1感受态细胞的MOI＝100：1，辅助噬菌体M13K07的滴度为10～12pfu/mL。

5.根据权利要求1或4所述的GII.17型诺如病毒全人源中和性单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤S2中富集性筛选具体为将GII.17NoV P颗粒包被免疫管，吸附噬菌体单链抗体库，然后采用甘氨酸-盐酸洗脱法进行富集性淘选，重复进行4轮吸附-洗涤-洗脱-感染-拯救的过程，获得与GII.17NoV P颗粒结合的噬菌体，然后将与GII.17NoV P颗粒结合的噬菌体洗脱下来用于扩增。