[发明专利]一种羊口疮灭活疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种羊口疮灭活疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)细胞制备

从工作细胞库中取出冻存的山羊睾丸细胞GT-26，置37℃水浴中解冻，1000-1500r/min离心5-8min，弃掉上清，用含8-10％新生牛血清的MEM培养基重悬后，接种25cm³细胞瓶，置37℃、含5％CO₂培养箱中培养至细胞长成致密单层，用0.25％胰酶消化，按1：3～4传代，扩大培养；将扩大培养的山羊睾丸细胞GT-26接种到细胞转瓶中，置37℃培养至细胞长成致密单层，转速为8-11r/h；

(2)病毒转瓶培养及收获

将转瓶中已长成良好单层的山羊睾丸细胞GT-26，弃去培养基，按1％(V/V)的比例加入羊口疮病毒ORFV-WF-3，并按照转瓶10％的容积加入MEM培养基，置37℃温室培养，转速为8-11r/h，每天观察细胞病变，培养48～72h收获病毒液，置-20℃以下保存；

(3)病毒液灭活

加待灭活病毒液总体积0.1％-0.25％的BPL于待灭活病毒液中，轻轻混匀后，置于4℃恒温震荡作用12-24h，灭活完全后，将灭活好的病毒液置于37℃水浴震荡2-3h，使佐剂失活，获得灭活病毒液；

(4)疫苗制备

A、配苗

取滴度为10^-7～10^-7.5TCID₅₀的灭活病毒液和佐剂Montanide ISA206，分别加热至30±2℃；将Montanide ISA206倒入双层夹套容器并将温度保持在28-32℃；以150-250r/min低速搅拌，并按照1：1的质量比，逐渐将加热后的灭活病毒液加入Montanide ISA206中，流速5～6L/min；

B、乳化

待灭活病毒液全部加入后，提高搅拌速度至250-500r/min，28-32℃持续搅拌20～30min；将容器冷却至4-15℃，并在冷却过程中持续搅拌；停止搅拌，将乳液在4-15℃静置16-36h，获得羊口疮灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种羊口疮灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述山羊睾丸细胞GT-26的保藏编号为CCTCC NO：C201734。

3.根据权利要求1所述的一种羊口疮灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述羊口疮病毒ORFV-WF-3的保藏编号为CGMCC No.17993。