[发明专利]一种羊口疮灭活疫苗的制备方法

说明书

本发明公开了一种羊口疮灭活疫苗的制备方法，属于免疫工程技术领域。本发明公开的一种羊口疮灭活疫苗的制备方法，包括细胞制备、病毒转瓶培养及收获、病毒液灭活、疫苗制备。本发明公开的一种羊口疮病毒的灭活疫苗的制备方法，获得的疫苗具有良好的免疫效果，填补了国内羊口疮灭活疫苗的空白。

技术领域

本发明涉及免疫工程技术领域，更具体的说是涉及一种羊口疮灭活疫苗的制备方法。

背景技术

目前，在我国养羊业进入快速发展期，同时各种疫病防控工作也被大家所重视。羊口疮，又称为羊传染性脓疱，是由病毒引起的一种接触性传染病，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和结成疣状结痂为特征。羊口疮普遍存在于各种羊群(包括奶山羊、绒山羊以及肉羊)中，并对其造成严重的后果，带来巨大的损失，尤其是新生羔羊发病率可达60％，死亡率最高达10％。疫苗作为其有效的最预防手段，保护效果达到80％以上。

因此，提供一种羊口疮灭活疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种羊口疮灭活疫苗的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种羊口疮灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：

(1)细胞制备

从工作细胞库中取出冻存的山羊睾丸细胞GT-26，置37℃水浴中解冻，1000-1500r/min离心5-8min，弃掉上清，用含8-10％新生牛血清的MEM培养基重悬后，接种25cm³细胞瓶，置37℃、含5％CO₂培养箱中培养至细胞长成致密单层，用0.25％胰酶消化，按1：3～4传代，扩大培养；将扩大培养的山羊睾丸细胞GT-26接种到细胞转瓶中，置37℃培养至细胞长成致密单层，转速为8-11r/h；

(2)病毒转瓶培养及收获

将转瓶中已长成良好单层的山羊睾丸细胞GT-26，弃去培养基，按1％(V/V)的比例加入羊口疮病毒ORFV-WF-3，并按照转瓶10％的容积加入MEM培养基，置37℃温室培养，转速为8-11r/h，每天观察细胞病变，培养48～72h收获病毒液，置-20℃以下保存；

(3)病毒液灭活

BPL(β-丙内酯)灭活病毒(保存于-20℃)

加待灭活病毒液总体积0.1％-0.25％的BPL于待灭活病毒液中，轻轻混匀后，置于4℃恒温震荡作用12-24h(或者期间轻轻混匀6-8次)，灭活完全后，将灭活好的病毒液置于37℃水浴震荡2-3h，使佐剂失活，获得灭活病毒液；

(4)疫苗制备

A、配苗

取滴度为10^-7～10^-7.5TCID₅₀的灭活病毒液和佐剂Montanide ISA206，分别加热至30±2℃；将Montanide ISA206倒入双层夹套容器并将温度保持在28-32℃；以150-250r/min低速搅拌，并按照1：1的质量比，逐渐将加热后的灭活病毒液加入Montanide ISA206中，流速5～6L/min；

B、乳化

待灭活病毒液全部加入后，提高搅拌速度至250-500r/min，28-32℃持续搅拌20～30min；将容器冷却至4-15℃，并在冷却过程中持续搅拌；停止搅拌，将乳液在4-15℃静置16-36h，获得羊口疮灭活疫苗。

山羊睾丸细胞GT-26的保藏编号为CCTCC NO：C201734，参见专利201710372048.9，一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系及其建立方法。