[发明专利]一种基于生物素-亲和素系统双检测线免疫层析试纸条半定量检测黄曲霉毒素B1

权利要求书

1.一种基于生物素-亲和素系统双检测线免疫层析试纸条半定量检测黄曲霉毒素B1的制备方法其特征在于，包括以下步骤：

（1）亲和素化柱状纳米金材料的制备：先将 0.3-0.4 g 0.2 mol/L 的季铵盐类化合物与0.001 mol/L 5.00 mL的氯金酸水溶液室温下充分混合，加入0.01 mol/L 0.90 mL的碱性溶液，反应5 min，生成种子，然后将0.3 g 0.2 mol/L氯化季铵盐加入0.04 mol/L 0.10m的盐溶液与0.001 mol/L 1-10 mL的氯金酸混合液，再加入浓度为 0.0788 mol/L 0.10mL的抗坏血酸水溶液，然后将得到的0.01-0.05 ml的种子液加入该溶液反应1-5 min，室温下恒温静置24 h后以14000 r/min 的转速离心，然后将6 ml亲和素(1-5×10^-8 M)加入得到的溶液以12000 r/min转速离心10分钟三次，然后每次将沉淀物悬浮在含有0.1% PEG的季铵盐中；并将其保持在0-10℃用于进一步使用；

（2）生物素化抗AFB₁单克隆抗体的制备：①配制pH 9.2、0.1 mol/L缓冲液1、pH 7.2、0.05 mol/L缓冲液2；②用二甲基甲酰胺将生物素配制成 38 mg/ml 溶液;用pH 9.2、0.1mol/L缓冲液1将纯化单克隆抗体稀释为 6.0 mg/ml, 装入透析袋中对缓冲液1透析；③按生物素:单克隆抗体的质量比为 1∶10 室温搅拌下混合反应1-10 h；④在反应混合液中加入48 μl、1 mol/L的NH₄Cl,孵育后将反应混合物装入透析袋, 0-20 ℃下对缓冲液2透析过夜；

（3）基于生物素-亲和素系统金标探针的制备：利用生物素和亲和素之间高特异性亲和力以及多级放大效应，可提高免疫结合和示踪分析的灵敏度；生物素与亲和素之间的结合力可达1015 mol L^-1,且两者结合快速，耐受性强；

(4) 基于生物素-亲和素系统双检测线免疫层析试纸条半定量检测黄曲霉毒素B1：首先进行免疫层析试纸条的制备：通过将亲和素与柱状纳米金共价结合作为标记探针，采用共价偶联的方式连接生物素与抗黄曲霉毒B1单克隆抗体结合的聚合物形成偶联物然后喷到玻璃纤维素膜上，将抗原1与抗原2和羊抗鼠 IgG 分别包被硝酸纤维素膜的T线（有两条T线——T1和T2）和C线上；当奶粉中待测物的含量低于0.05 μg/kg, NC膜上出现三条红色条带（T1、T2和C线）；当奶粉中AFB1浓度高于0.05 μg/kg低于0.5 μg/kg，NC膜上出现两条红色条带（T1和C线）；当奶粉中AFB1的含量大于0.5 μg/kg，NC膜上出现一条红色条带（C线）。

2.根据权利要求书1所述的一种基于生物素-亲和素系统双检测线免疫层析试纸条半定量检测黄曲霉毒素B1的制备步骤（1）所述的季铵盐类化合物是四丁基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、氯化十二烷基二甲基苄基铵、溴化双十八烷基二甲基铵、十八烷基二甲基羟乙基铵硝酸盐的一种或多种；所述的碱性溶液是氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液、氢化锂铝溶液、硼氢化钠溶液的一种或几种；所述的盐溶液是氯化钠溶液、硝酸钙溶液、硝酸银溶液、硝酸钠溶液的一种或几种。

3.根据权利要求书1所述的一种基于生物素-亲和素系统双检测线免疫层析试纸条半定量检测黄曲霉毒素B1的制备步骤（2）缓冲液1、2是醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液中的一种或多种。