[发明专利]一种基于生物素-亲和素系统双检测线免疫层析试纸条半定量检测黄曲霉毒素B1

说明书

本发明涉及了.一种基于生物素‑亲和素系统双检测线免疫层析试纸条半定量检测黄曲霉毒素B1的制备方法，包括以下步骤：通过将亲和素与柱状纳米金共价结合作为标记探针，采用共价偶联的方式连接生物素与抗黄曲霉毒B1纳米抗体结合的聚合物形成偶联物然后喷到玻璃纤维素膜上，将抗原1与抗原2和羊抗鼠IgG分别包被硝酸纤维素膜的T线（有两条T线——T1和T2）和C线上，根据试纸条上检测线和质控线的显色情况半定量检测奶粉中的黄曲霉毒素B1,具有简便，快速，灵敏度高的特点，克服了目前检测方法存在的操作繁琐，检测时间长的缺点，有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种基于生物素-亲和素系统双检测线免疫层析试纸条半定量检测黄曲霉毒素B1的的制备方法。

背景技术

黄曲霉毒素是真菌毒素的一种，是目前已知的最强的三大化学致癌物之一，目前，黄曲霉毒素的检测方法主要有理化检测法和快检免疫检测法，理化检测主要有 HPLC、HPLC-MS、TLC等，检测灵敏度高，比较普及且成熟，检测成本高; 快检免疫检测法主要有ELISA法、胶体金免疫层析法和量子点荧光免疫层析法等，操作简便，省时省力，成本较低，结果直观且适用于现场筛查。免疫层析法是近年来用于快速检验及诊断的新技术，快检主要优势在于其技术简单，操作简便，用时较少，省时省力，节省检测成本，相对HPLC 法等方法来说，仪器设备要求较少，价格低廉，检测结果直观，可用于现场检测。

发明内容

发明本发明涉及一种基于生物素-亲和素系统双检测线免疫层析试纸条半定量检测黄曲霉毒素B1的制备方法。

一种基于生物素-亲和素系统双检测线免疫层析试纸条半定量检测黄曲霉毒素B1的的制备方法，其步骤如下：

所述的的亲和素化柱状纳米金材料的制备：先将 0.3-0.4 g 0.2 mol/L 的季铵盐类化合物与0.001 mol/L 5.00 mL的氯金酸水溶液室温下充分混合，加入0.01 mol/L0.90 mL的碱性溶液，反应5 min，生成种子，然后将0.3 g 0.2 mol/L氯化季铵盐加入0.04mol/L 0.10 m的盐溶液与0.001 mol/L 1-10 mL的氯金酸混合液，再加入浓度为 0.0788mol/L 0.10 mL的抗坏血酸水溶液，然后将得到的0.01-0.05 ml的种子液加入该溶液反应1-5 min，室温下恒温静置24 h后以14000 r/min 的转速离心，然后将6 ml亲和素(1-5×10^-8M)加入得到的溶液以12000r/min转速离心10分钟三次，然后每次将沉淀物悬浮在含有0.1%PEG的季铵盐中。并将其保持在0-10℃用于进一步使用。

所述的生物素化抗AFB₁单克隆抗体的制备：①配制pH 9.2、0.1 mol/L缓冲液1、pH7.2、0.05 mol/L缓冲液2。②用 二甲基甲酰胺将生物素配制成 38 mg/ml 溶液;用pH 9.2、0.1 mol/L缓冲液1将纯化单克隆抗体稀释为 6.0 mg/ml, 装入透析袋中对缓冲液1透析。③按生物素: 单克隆抗体的质量比为 1∶10 室温搅拌下混合反应1-10 h。④在反应混合液中加入48 μl、1 mol/L的NH₄Cl,孵育后将反应混合物装入透析袋, 0-20 ℃下对缓冲液2透析过夜。

所述的基于生物素-亲和素系统金标探针的制备：利用生物素和亲和素之间高特异性亲和力以及多级放大效应，可提高免疫结合和示踪分析的灵敏度。生物素与亲和素之间的结合力可达1015mol L^-1,且两者结合快速，耐受性强。

所述的免疫层析试纸条的制备：通过将亲和素与柱状纳米金共价结合作为标记探针，采用共价偶联的方式连接生物素与抗黄曲霉毒B1单克隆抗体结合的聚合物形成偶联物然后喷到玻璃纤维素膜上，将抗原1与抗原2和羊抗鼠 IgG 分别包被硝酸纤维素膜的T线（有两条T线——T1和T2）和C线上。

所述的季铵盐类化合物是四丁基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、氯化十二烷基二甲基苄基铵、溴化双十八烷基二甲基铵、十八烷基二甲基羟乙基铵硝酸盐的一种或多种。