[发明专利]一种鉴定人生长激素蛋白质存在形式生物标志物谱的方法

权利要求书

1.一种鉴定人生长激素蛋白质存在形式生物标志物谱的方法，其特征在于，该方法为：

S1、收集人生长激素分泌型垂体腺瘤和正常垂体组织样本，分别裂解组织并提取两组组织蛋白质；

S2、将S1中得到的每组组织蛋白质均分成两份，分别进行双向凝胶电泳，得到含有蛋白质的双向凝胶，均命名为含有蛋白质的双向凝胶a和含有蛋白质的双向凝胶b；

S3、将S2中得到的含有蛋白质的双向凝胶a进行蛋白印迹，得到可视化PVDF膜；

S4、将S2中得到的含有蛋白质的双向凝胶b浸泡在考马斯亮蓝染色液中，得到用考马斯亮蓝染色的双向凝胶b；将S3中进行完蛋白印迹后的含有蛋白质的双向凝胶a浸泡在考马斯亮蓝染色液中，得到用考马斯亮蓝染色的双向凝胶a；

S5、将S3中得到的可视化PVDF膜、S4中得到的考马斯亮蓝染色的双向凝胶b和用考马斯亮蓝染色的双向凝胶a扫描到数字化图像中，将所述数字化图像导入到Bio-Rad PDQuest双向凝胶图像分析软件中定量蛋白质点的体积，将呈免疫阳性的蛋白印迹点与相应的用考马斯亮蓝染色的双向凝胶a和用考马斯亮蓝染色的双向凝胶b的蛋白质点相匹配；

S6、将S4中得到的用考马斯亮蓝染色的双向凝胶a和用考马斯亮蓝染色的双向凝胶b中的凝胶点中与S3中所述可视化PVDF膜中呈免疫阳性的蛋白印迹点相对应的双向凝胶蛋白质点，用胰蛋白酶酶解所述双向凝胶蛋白质点中的蛋白质，抽提胰蛋白酶酶解肽混合物，然后用ZipTipC₁₈微柱进行纯化，得到纯化后的胰蛋白酶酶解肽混合物；

S7、将S6中得到的纯化后的胰蛋白酶酶解肽混合物进行MALDI-TOF-MS分析、LC-ESI-MS/MS分析或者MALDI-TOF-TOF-MS/MS分析，得到质谱图；

S8、将S7中得到的质谱图的PMF数据和MS/MS数据输入Mascot搜索引擎中，并在UniProt数据库搜索蛋白质进行鉴定；

S9、采用肽质量工具计算GH受胰蛋白酶酶解后的理论肽质量，与GH前体、成熟GH、及GH剪接变异体1、2、3和4的理论序列比对，确定GH前体和成熟GH以及GH剪接变异体1、2、3和4的特征性胰蛋白酶酶解肽；将得到的所述特征性胰蛋白酶酶解肽与S7中得到的每张质谱图进行比对，确定每个GHP是否源于GH前体和成熟GH以及GH剪接变异体1、2、3和4；所述GH前体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述成熟GH的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述GH剪接变异体1序列如SEQ ID NO:3所示，所述GH剪接变异体2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述GH剪接变异体3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述GH剪接变异体4的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

S10、对生长激素分泌型垂体腺瘤和正常垂体组织进行定量磷酸化蛋白组学，将两种组织的蛋白质分别进行胰蛋白酶酶解，通过iTRAQ试剂标记胰蛋白酶肽混合物、用TiO₂富集磷酸化肽，用LC-MS/MS分析鉴定磷酸蛋白质的氨基酸序列和磷酸化位点，并量化每个磷酸肽的丰度；将获得的GH磷酸化位点所在的胰蛋白酶肽与S7中获得的每张质谱图进行比对，以确定GHP的磷酸化状态；

S11、对生长激素分泌型垂体腺瘤和正常垂体组织进行定量泛素化蛋白组学，将两种组织的蛋白质分别进行胰蛋白酶酶解，从得到的胰蛋白酶肽混合物中用泛素抗体富集泛素化肽，用LC-MS/MS分析鉴定泛素化蛋白质的氨基酸序列和泛素化位点，并用无标签定量方法定量泛素化肽的丰度；将获得的GH泛素化位点所在的胰蛋白酶肽与S7中获得的每张质谱图进行比对，以确定GHP的泛素化状态；

S12、对生长激素分泌型垂体腺瘤和正常垂体组织进行定量乙酰化蛋白组学，将两种组织的蛋白质分别进行胰蛋白酶酶解，从得到的胰蛋白酶肽混合物中用乙酰抗体富集乙酰化肽，用LC-MS/MS分析鉴定乙酰化蛋白质的氨基酸序列和乙酰化位点，并用无标签定量方法定量乙酰化肽的丰度；将获得的GH乙酰化位点所在的胰蛋白酶肽与S7中获得的每张质谱图进行比对，以确定GHP的乙酰化状态。