[发明专利]一种鉴定人生长激素蛋白质存在形式生物标志物谱的方法

说明书

本发明提供了一种鉴定人生长激素蛋白质存在形式生物标志物谱的方法，该方法为：收集人生长激素分泌型垂体腺瘤和正常垂体组织样本，分别提取组织蛋白质，经双向凝胶电泳、蛋白印迹、考马斯亮蓝染色，将可视化PVDF膜和双向凝胶扫描到数字化图像中，相对应的双向凝胶蛋白点用胰蛋白酶消化后纯化，经质谱鉴定、生物信息学分析，鉴定GHP生物标志物谱；用定量磷酸化蛋白质组学、泛素化蛋白质组学和乙酰化蛋白质组学分析结合生物信息学鉴定GHP上的翻译后修饰及剪切变异。本发明可鉴定生长激素分泌型垂体腺瘤与正常垂体组织间GHP变化模式，46种GHPs在生长激素分泌型垂体腺瘤中被鉴定，35种在正常垂体组织中被鉴定，11种仅在生长激素分泌型垂体腺瘤组织中出现。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定人生长激素蛋白质存在形式生物标志物谱的方法。

背景技术

垂体腺瘤是最常见的原发性颅内肿瘤之一，患病率占全球的17％。垂体腺瘤分泌异常的生长激素(Growth hormone；GH)可致临床疾病，在儿童时期，过量的GH分泌导致异常大的骨骼形成巨人症，然而GH分泌不足导致侏儒症；在成人中，由垂体腺瘤引起的GH分泌过多导致肢端肥大症。垂体腺瘤导致一些GH相关疾病长期影响人类的健康。尽管目前有药物治疗以及手术切除等多种治疗手段和方式，但垂体腺瘤导致的一系列GH相关疾病在临床治疗效果上仍然不理想。因此，寻找垂体腺瘤的生长激素蛋白质存在形式(Growth hormoneproteoform；GHP)生物标志物和相关生长激素疾病的GHP生物标志物是治疗垂体腺瘤和生长激素相关疾病的关键手段之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种鉴定人生长激素蛋白质存在形式生物标志物谱的方法，该方法可鉴定生长激素分泌型垂体腺瘤与正常垂体组织之间GHPs的变化模式，46种GHPs在生长激素分泌型垂体腺瘤中被鉴定，35种GHPs在正常垂体组织中被鉴定；其中11种GHPs仅在生长激素分泌型垂体腺瘤组织中出现，而正常垂体组织中没有出现。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种鉴定人生长激素蛋白质存在形式生物标志物谱的方法，该方法为：

S1、收集人生长激素分泌型垂体腺瘤和正常垂体组织样本，分别裂解组织并提取两组组织蛋白质；

S2、将S1中得到的每组组织蛋白质均分成两份，分别进行双向凝胶电泳，得到含有蛋白质的双向凝胶，均命名为含有蛋白质的双向凝胶a和含有蛋白质的双向凝胶b；

S3、将S2中得到的含有蛋白质的双向凝胶a进行蛋白印迹，得到可视化PVDF膜；

S4、将S2中得到的含有蛋白质的双向凝胶b浸泡在考马斯亮蓝染色液中，得到用考马斯亮蓝染色的双向凝胶b；将S3中进行完蛋白印迹后的含有蛋白质的双向凝胶a浸泡在考马斯亮蓝染色液中，得到用考马斯亮蓝染色的双向凝胶a；

S5、将S3中得到的可视化PVDF膜、S4中得到的考马斯亮蓝染色的双向凝胶b和用考马斯亮蓝染色的双向凝胶a扫描到数字化图像中，将所述数字化图像导入到Bio-RadPDQuest双向凝胶图像分析软件中定量蛋白质点的体积，将呈免疫阳性的蛋白印迹点与相应的用考马斯亮蓝染色的双向凝胶a和用考马斯亮蓝染色的双向凝胶b的蛋白质点相匹配；

S6、将S4中得到的用考马斯亮蓝染色的双向凝胶a和用考马斯亮蓝染色的双向凝胶b中的凝胶点中与S3中所述可视化PVDF膜中呈免疫阳性的蛋白印迹点相对应的双向凝胶蛋白质点，用胰蛋白酶酶解所述双向凝胶蛋白质点中的蛋白质，抽提胰蛋白酶酶解肽混合物，然后用ZipTipC₁₈微柱进行纯化，得到纯化后的胰蛋白酶酶解肽混合物；

S7、将S6中得到的纯化后的胰蛋白酶肽混合物进行MALDI-TOF-MS分析、LC-ESI-MS/MS分析或着MALDI-TOF-TOF-MS/MS分析，得到质谱图；