[发明专利]一种钙粘素融合蛋白改进复合微球的制备与应用

说明书

一种钙粘素融合蛋白改进复合微球的制备与应用。本发明涉及上皮细胞钙粘素‑Fc融合蛋白和神经细胞钙粘素‑Fc融合蛋白改性基质及其制备方法，以及其在促进细胞免疫调控功能和/或促进软骨修复中的应用。

技术领域

本发明涉及改性生物材料复合微球的制备及其调控干细胞功能维持的生物医学基础与应用开发领域，尤其是研制涉及干细胞免疫调控和软骨修复领域。更具体地，涉及生物材料壳-核结构复合微球的制备，涉及上皮细胞钙粘素(hE-钙粘素)-Fc融合蛋白和/或神经细胞钙粘素(hN-钙粘素)-Fc融合蛋白协同及其改性生物材料复合微球的新用途，其促进间充质干细胞免疫调控和软骨修复功能。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)由于其广泛的来源，自我更新和旁分泌能力已成为细胞治疗和组织修复的主要候选药物。将MSCs与微球结合制备成工程化细胞可以更好地保留MSCs的先天特性，增强其治疗效果。其中微球粒径的均一性对工程化细胞内部结构的均质性以及其负载的可溶性蛋白和小分子的释放至关重要。

传统的微球制备技术主要是乳液聚合法，依靠磁力搅拌或超声产生的不同转速带来的剪切力的不同制备微球，所产生微球的粒径不均和批次间差异容易导致微球的降解不一致和释放药物的稳定性下降。微流体液滴技术应用互不相溶流体间稳定剪切力不仅可以有效地制备高度均匀的单分散微球无需二次纯化，而且可以通过调节微流控芯片结构、装置及微流控工艺来制备不同结构的微球，但其芯片加工成本高、工艺复杂不易于操作。

利用生物材料仿生构建细胞外微环境指导细胞的行为和功能，在现代再生医学和组织工程中占据着重要地位。目前的研究普遍认为MSCs的免疫调控能力具有可塑性，即MSCs的免疫调控能力可以在体外培养的过程中获得或增强，因此如何通过人为调控细胞间的相互作用获得高生物功能的干细胞是研究人员一直致力于解决的关键问题。钙粘素(cadherin，在本文中缩写为cad)蛋白是一类Ca²⁺依赖的细胞表面跨膜糖蛋白，是细胞粘附分子家族中重要的一员，经典钙粘素是一类具有严格细胞特异性的跨膜糖蛋白，其胞外域介导同源细胞连接(即黏合连接)，胞内域与胞内α、β和γ连环蛋白相连，调控肌动蛋白纤维并参与多种信号转导，具有建立细胞极性、维持细胞形态和组织器官完整性的功能、同时也是细胞分化和形态发生的重要调控因子。上皮钙粘素(E-cad)是一类在上皮细胞和胚胎干细胞中介导细胞间粘附作用的跨膜糖蛋白，对于小鼠胚胎早期的上皮形成、细胞重排、组织形态发生、细胞极性的建立和组织结构的维持至关重要。N-钙粘素蛋白(N-cad)是软骨形态发生发育中间质凝结过程的重要标志物之一，N-钙粘素的高表达被证明可以促进间充质干细胞发生间质凝结过程，但是持续的增强N-钙粘素的表达，也会抑制间质凝结过程后续的软骨分化的进程，所以对细胞自身N-钙粘素表达的时空调控至关重要。此外，通过定向诱导分化成熟的软骨细胞很难维持稳定透明软骨的特性，极易发生肥大等现象，进而进行钙化，从而丧失软骨细胞特异性基质合成的能力及生理功能。

已有多种基于IgG Fc段与钙粘素胞外域的融合蛋白应用于组织工程及再生医学的研究当中，例如E-Cad-Fc、N-Cad-Fc等作为细胞外基质的改性成分之一用于研究对细胞行为调控的影响。

但目前为止，现有技术中并没有任何关于人上皮细胞钙粘素蛋白-Fc融合蛋白和人神经细胞钙粘素-Fc促进间充质干细胞免疫调控功能的报道。对于E-钙粘素的研究更多集中在促进上皮细胞功能等方面，目前并没有通过人上皮钙粘素-Fc融合蛋白和人神经钙粘素-Fc的联用促进干细胞向软骨细胞分化，并通过其对相关信号通路的调控抑制成熟软骨细胞钙化和对于关节软骨修复的研究。

发明内容

本发明人发现利用壳核结构复合微球(例如PLGA、PCL、壳聚糖、肝素、透明质酸、胶原)，并且利用上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和神经细胞钙粘素-Fc融合蛋白修饰，将会有利于间充质干细胞免疫调控和软骨修复的应用。