[发明专利]一种全血直接荧光PCR检测方法以及全血样本处理液在制备基因检测试剂盒中的应用

说明书

本发明公开了一种全血直接荧光PCR检测方法以及全血样本处理液在制备基因检测试剂盒中的应用，涉及基因检测技术领域，该检测方法采用全血样本处理液对全血样本进行预处理，可使血液样本经简单处理后即可直接用作后续荧光PCR的模板进行基因检测，大大简化了样本处理的操作流程，缩短了样本处理时间，降低了检测成本，并适合高通量检测的进行，适用范围广，可用于TaqMan探针检测体系和通用发卡探针检测体系，具有检测结果重复性、准确性好等优点。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种全血直接荧光PCR检测方法以及全血样本处理液在制备基因检测试剂盒中的应用。

背景技术

近年来，随着生物、医学和法医学等各相关领域的发展，基因检测技术得到越来约为广泛的应用，而血液样本则是基因检测中最为常见的样本类型之一。全血中存在有很多PCR反应抑制物，例如，血红素、蛋白质、盐和抗凝剂等，使得常规的Taq聚合酶不能从全血中直接进行PCR反应，因此，现有的基因检测技术如测序、基因芯片等，通常需要从全血中提取出高纯度和浓度的基因组DNA作为模板。通过提取处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过程往往伴随着较高的核酸损失，同时繁琐的提纯步骤增加了样本间交叉污染的风险，从而增加了后续检测失败的可能。此外，由于提取过程耗时长、成本高、步骤复杂，且需使用苯酚等有害试剂，增加了操作者感染的风险。因此，血液样本若能直接作为模板或经过简单处理就能够作为模板进行后续PCR扩增检测，省去提取的过程，将从时间、经济、结果准确性等多方面对现有基因检测技术进行提高。

血液直接扩增技术主要是通过全血样本预处理或/和基因工程改造DNA聚合酶来实现，全血样本预处理包括热处理(如95℃处理15min、90℃和50℃之间各暴露1min并循环20次)、化学试剂处理(如硫酸铵、明胶、甲酰胺、无机碱、Triton X-100、DMSO、H₂O₂)和微波辐射等；基因工程改造DNA聚合酶则具有较高的PCR抑制剂耐受性，商品化的酶常见的有Thermo Fisher的phusion DNA聚合酶和NEB的Hemo KlenTaq等。

现有的血液直接扩增技术虽然较常规的基因组DNA提取纯化过程有所简化，但全血样本的预处理仍然会涉及到额外的热循环、离心、加液和弃液等步骤，且条件难以控制、重复性差、不能形成商品化试剂盒，不利于推广使用。而基因工程改造DNA聚合酶法多为缺陷型Taq酶，与常规Taq DNA聚合酶相比保真度下降，同时，较普通Taq酶需要更高的成本。

荧光PCR是在PCR过程中加入了荧光基团或者荧光染料指示剂，对PCR产物进行标记跟踪，利用信号积累实时监测PCR反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析和计算。荧光PCR在反应的对数期检测，分析起始点产物的量、实时监测荧光信号、动力学范围广、有效鉴别非特异性扩增和突变、可以相对定量和绝对定量。虽然目前可用于基因检测的技术还有很多，如芯片法、测序法的，但综合考虑仪器设备成本、试剂耗材成本、方法开发难易程度、操作简便性、劳动强度以及检测通量等，荧光PCR仍是目前用于基因检测的最重要的检测技术方法之一。

目前的全血直接荧光PCR技术较少，且基本上都存在一定的局限性，CN107475252A提供的方法中全血样本的处理包含震荡、离心及热处理5～30min的步骤；CN106978501A提供的方法中全血样本的处理需要两步的加液及一步离心操作；CN111500735A提供的方法中需要进行两轮PCR，耗时较长且涉及开管操作，易造成气溶胶污染；CN111020026A和CN107058530A则分别使用了进口的PCR反应Mix和血液高耐受Taq酶，增加了检测的成本。因此，需要开发一种血液样本经过简单处理就可以作为模板进行荧光PCR扩增检测的方法，以满足科研和医学领域对于基因检测技术的快速、简便、成本低廉的要求。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全血直接荧光PCR检测方法以及全血样本处理液在制备基因检测试剂盒中的应用。