[发明专利]基因重组胶原寡肽的制备方法

权利要求书

1.基因重组胶原寡肽的制备方法，包括如下步骤：

S1、采用一对互补引物PCR反应合成MYS-1基因；

S2、用KpnI酶和XhoI酶分别对质粒pET32a和步骤S1制得的MYS-1基因进行双酶切，然后将双酶切后的MYS-1基因和双酶切后的质粒pET32a，得到重组质粒pET32a-MYS-1；

S3、用重组质粒pET32a-MYS-1转化表达宿主大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，得到表达工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)；

S4、诱导表达工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)表达由Trx标签蛋白、His标签蛋白和胶原寡肽MYS-1等组成的融合蛋白；

S5、表达的带His标签的融合蛋白用镍柱进行纯化：在蛋白上样后，带有His标签的融合蛋白特异性结合镍柱，其他的杂蛋白因不特异性结合镍柱而流出；用咪唑梯度洗脱，因咪唑与Ni2+结合可竞争性结合镍柱，进而释放融合蛋白，收集洗脱液；

S6、融合蛋白的酶切及目的多肽MYS-1的纯化；

S7、利用高效液相色谱技术纯化制备胶原寡肽MYS-1，得到高纯度基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1；

其中所述步骤S1中的引物为：

引物1：

引物2：

GGTACC为KpnI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点；

所述步骤S1中PCR反应的条件为：保持95℃5分钟，进行30次温度循环并最后保持70℃10分钟，所述温度循环为1分钟95摄氏度转至1分钟50℃再转至1分钟70℃。

2.根据权利要求1所述的基因重组胶原寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中，采用平缓缓冲液和洗涤缓冲液，所述平缓缓冲液的组成包括：50mMNa2HPO4，0.3MNaCl，pH＝8.0；

所述洗涤缓冲液包括如下成分：50mMNa2HPO4，0.3MNaCl，10～50mMimidazole，pH＝8.0。

3.根据权利要求1所述的基因重组胶原寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中，所述洗脱镍柱的溶液的组成优选如下：50mMNa2HPO4，0.3MNaCl，250mMimidazole，pH＝8.0。

4.根据权利要求1所述的基因重组胶原寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中，所述融合蛋白的酶切及目的多肽MYS-1的纯化步骤如下：

(1)将融合蛋白洗脱液置于1×PBS(pH7.6)缓冲液中透析，透析后融合蛋白溶液加入肠激酶(EK，5IU/μL)，加入量为每500μg融合蛋白加入5U肠激酶，酶切条件是：25℃条件下酶切6h；

(2)将酶切后的溶液体系过平衡好的Ni-NTA纯化柱，收集穿透液，用含250mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱柱子上的标签蛋白和其他结合杂蛋白，洗脱总体积为柱床的5倍，再生Ni-NTA纯化柱，收集的穿透液即为含有胶原寡肽MYS-1的初步纯化产物。

5.根据权利要求1所述的基因重组胶原寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，所述的利用高效液相色谱技术纯化胶原寡肽MYS-1的步骤如下：

A、流动相A为在体积百分比100％乙腈中添加三氟乙酸(TFA)得到，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流动相B为100％水中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流速1.0mL/min，20min线性梯度洗脱；

B、线性梯度洗脱中流动相B由55％～80％(v/v)，收集胶原寡肽MYS-1的洗脱峰，光吸收检测波长为218nm；并进行质谱鉴定。