[发明专利]基因重组胶原寡肽的制备方法

说明书

本发明公开了基因重组胶原寡肽的制备方法。基因重组胶原寡肽的制备方法，包括如下步骤：S1、采用一对互补引物PCR反应合成MYS‑1基因；S2、对MYS‑1基因进行双酶切，得到重组质粒；S3、用重组质粒转化表达宿主大肠杆菌，得到表达工程菌；S4、诱导表达工程菌表达融合蛋白；S5、进行纯化：收集洗脱液；S6、融合蛋白的酶切及目的多肽MYS‑1的纯化；S7、利用高效液相色谱技术纯化制备胶原寡肽MYS‑1，得到高纯度基因重组高稳定性胶原寡肽MYS‑1。本发明制备的胶原寡肽长度远小于天然人胶原蛋白及相关水解多肽，分子量小、制备容易且效率高，具有良好的抗氧化、抗衰老、促修复、抑制黑色素生成等生物活性。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及基因重组胶原寡肽的制备方法。

背景技术

胶原蛋白是一种高分子功能性蛋白质，它是皮肤的主要组成部分，占皮肤真皮层80％的比重，它在皮肤中构成了一张细密的弹力网，牢固锁住水分,支撑着皮肤。

随着年龄的增长，胶原蛋白会逐渐的流失，从而导致支撑皮肤的胶原肽键和弹力网断裂，其螺旋网状结构随即被破坏，皮肤组织被氧化、萎缩、塌陷，肌肤就会出现干燥、皱纹、松弛无弹性等衰老现象，所以，女性补充胶原蛋白是一种延衰的必须。胶原蛋白之父布兰特博士断言：“根本上来讲皮肤衰老过程，就是胶原蛋白流失的过程”。长期服用翌生美LOC胶原蛋白，不仅能帮您修复断裂、老化的纤维弹力网、稳固其结构造型，更能让您拥有一个属于自己的“真皮水库”。当真皮层的胶原纤维弹力网被氧化、断裂后，对表皮的支撑作用就消失了，水分就无法锁住和储存；因此造成不均一的塌陷，这样皱纹就产生了。

目前，胶原蛋白生产主要有传统提取、化学合成及基因重组制备技术。传统提取技术通过水解天然胶原得到系列水解产物，但其免疫原性的应用风险难以避免；化学合成胶原蛋白的成本高；基因重组技术具有产率高、成本低、生产的蛋白、多肽或寡肽活性高、无病毒隐患等优势，使得基因重组小分子胶原多肽具有良好的产业化前景，具有巨大的市场应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗衰老效果的基因重组胶原寡肽的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，基因重组胶原寡肽的制备方法，如下步骤：

S1、采用一对互补引物PCR反应合成MYS-1基因；

S2、用KpnI酶和XhoI酶分别对质粒pET32a和步骤S1制得的MYS-1基因进行双酶切，然后将双酶切后的MYS-1基因和双酶切后的质粒pET32a，得到重组质粒pET32a-MYS-1；

S3、用重组质粒pET32a-MYS-1转化表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到表达工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)；

S4、诱导表达工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)表达由Trx标签蛋白、His标签蛋白和胶原寡肽MYS-1等组成的融合蛋白；

S5、表达的带His标签的融合蛋白用镍柱进行纯化：在蛋白上样后，带有His标签的融合蛋白特异性结合镍柱，其他的杂蛋白因不特异性结合镍柱而流出；用咪唑梯度洗脱，因咪唑与Ni2+结合可竞争性结合镍柱，进而释放融合蛋白，收集洗脱液；

S6、融合蛋白的酶切及目的多肽MYS-1的纯化；

S7、利用高效液相色谱技术纯化制备胶原寡肽MYS-1，得到高纯度基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1；

其中步骤S1中的引物为：

引物1：

引物2：