[发明专利]一种重组高纯度的非洲猪瘟病毒pK205R亚单位蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组高纯度的非洲猪瘟病毒pK205R亚单位蛋白及其制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述制备方法如下：1)重组杆状病毒获得：将密码子优化后的非洲猪瘟病毒pK205R蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的表达基因克隆到转移载体pBacPAK8中，然后与线性化的DNA质粒共转染昆虫细胞，得到含有非洲猪瘟病毒pK205R亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒；2)发酵培养：再将所述重组杆状病毒进行扩大培养后进行发酵，收集培养液；3)亚单位蛋白纯化：对步骤2)中所述培养液进行纯化，纯化后得到重组的非洲猪瘟病毒pK205R亚单位可溶性蛋白。本发明能够提供一种可大规模工业化生产的非洲猪瘟蛋白pK205R亚单位蛋白且制备方法简单、成本低能够达到国家现有标准。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域。涉及一种高纯度非洲猪瘟pK205R蛋白大规模制备方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病，发病率及死亡率高达100％。猪感染非洲猪瘟病毒后出现皮肤充血，内脏器官出血，高热为特征临床症状，猪是ASFV自然感染的唯一哺乳动物宿主，包括家猪和野猪，尤其是家猪，易感性极高，对畜牧业影响巨大。世界动物卫生组织将其列为A类疫病，我国也将其列为一类动物传染病。

该病最早在1921年于非洲的肯尼亚国家确认发生，对非洲乃至全球多个国家的养猪业造成极大打击。2018年8月份以来，在我国多个省份爆发，给我国养猪业带来了严重的经济损失。虽然，国内外学者对非洲猪瘟做了大量的研究工作，但研究发现：常规制备的非洲猪瘟灭活苗效果不明显，而弱毒苗保护效果也不好，且安全性差，易造成散毒。目前，世界上尚未有有效预防非洲猪瘟的疫苗和治疗该病的药物发现，迫切需要新型疫苗的研发和生产来预防非洲猪瘟。

ASFV病毒是具有囊膜的虫媒DNA病毒。病毒颗粒呈二十面体对称结构，平均直径200nm，表面有含糖脂类的囊膜覆盖。其病毒基因组为双股线性DNA，大小为170-190kb，整个基因组大约有150个ORF，编码150-200中蛋白质。K205R基因是一早期转录基因，目前对该基因研究较少，推测该基因可能参与病毒的组装。pK205R蛋白由K205R基因编码的病毒蛋白，pK205R蛋白能较早刺激机体产生抗体，对病毒感染早期的诊断和治疗具有重要作用。世界动物卫生组织(OIE)推荐的诊断ASFV的方法主要是病原鉴定和血清学试验，病原鉴定存在操作繁琐或者仪器昂贵、存在生物安全的风险等一系列缺点；在血清学检测技术中，ELISA是OIE规定的国际贸易检验方法，但需要制备检测抗原，当前的技术存在的缺陷是不能在原核表达系统中大规模表达，且纯化后的蛋白纯度较低，本发明成功构建一种能高表达pK205R蛋白的重组杆状病毒，并结合简单快速的纯化方法，得到大量高纯度的pK205R蛋白，且得到的pK205R蛋白不论是在空间结构，还是在翻译后修饰等方面与天然蛋白更为接近，能提高检测方法的特异性，为非洲猪瘟诊断和预防提供重要帮助。

发明内容

为解决现有技术的上述技术问题，本发明提供本发明提供非洲猪瘟pK205R亚单位蛋白。本发明还提供一种非洲猪瘟pK205R亚单位蛋白的制备方法及利用该蛋白制备一种重组的高纯度非洲猪瘟病毒pK205R亚单位蛋白总抗体检测方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种重组高纯度的非洲猪瘟病毒pK205R亚单位蛋白，所述重组高纯度的非洲猪瘟病毒pK205R亚单位蛋白为非洲猪瘟病毒蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的优选技术方案中，密码子优化后的所述重组高纯度的非洲猪瘟病毒pK205R亚单位蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。密码子优化前的所述重组高纯度的非洲猪瘟病毒pK205R亚单位蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种重组高纯度的非洲猪瘟pK205R亚单位蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：