[发明专利]一种重组的非洲猪瘟病毒DP96R亚单位蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组的非洲猪瘟病毒结构蛋白DP96R亚单位蛋白及其制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述制备方法如下：1)将密码子优化后的所述重组的非洲猪瘟病毒DP96R蛋白如SEQ ID NO.1所示的编码基因序列克隆到原核表达载体中，得到含有非洲猪瘟病毒DP96R亚单位蛋白编码基因的重组质粒；2)再将所述含有非洲猪瘟病毒DP96R亚单位蛋白编码基因的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中，得到重组工程菌；3)通过培养、筛选步骤2)中所述重组工程菌的菌株，得到高度表达的菌株；4)发酵培养步骤3)中所述高度表达的菌株，纯化后得到重组的非洲猪瘟病毒DP96R亚单位可溶性融合蛋白。本发明能够提供一种可大规模工业化生产的非洲猪瘟毒力相关蛋白DP96R亚单位蛋白且制备方法简单、成本低能够达到国家现有标准。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域。涉及一种非洲猪瘟DP96R蛋白制备方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病，发病率及死亡率高达100％。猪感染非洲猪瘟病毒后出现皮肤充血，内脏器官出血，高热为特征临床症状，猪是ASFV自然感染的唯一哺乳动物宿主，包括家猪和野猪，尤其是家猪，易感性极高，对畜牧业影响巨大。世界动物卫生组织将其列为A类疫病，我国也将其列为一类动物传染病。

该病最早在1921年于非洲的肯尼亚国家确认发生，对非洲乃至全球多个国家的养猪业造成极大打击。2018年8月份以来，在我国多个省份爆发，给我国养猪业带来了严重的经济损失。虽然，国内外学者对非洲猪瘟做了大量的研究工作，但研究发现：常规制备的非洲猪瘟灭活苗效果不明显，而弱毒苗保护效果也不好，且安全性差，易造成散毒。目前，世界上尚未有有效预防非洲猪瘟的疫苗和治疗该病的药物发现，迫切需要新型疫苗的研发和生产来预防非洲猪瘟。

ASFV病毒是具有囊膜的虫媒DNA病毒。病毒颗粒呈二十面体对称结构，平均直径200nm，表面有含糖脂类的囊膜覆盖。其病毒基因组为双股线性DNA，大小为170-190kb，整个基因组大约有150个ORF，编码150-200中蛋白质。UK基因位于非洲猪瘟病毒基因组右侧可变区，含有92-156个氨基酸，是一个新发现的基因，它包括4-10个串联重复区。UK基因在不同病毒毒株基因组中序列高度保守，属于病毒毒力相关基因，是导致家猪发病重要因素之一，致病性ASFV缺失UK基因并不影响病毒在体外巨噬细胞中的生长，但其对猪的毒力会大大降低。研究表明，筛除UK基因后ASFV的毒力大大减弱，可以作为弱毒苗的研发；DP96R蛋白是由UK基因编码的病毒毒力蛋白，大小为15kD左右，主要在病毒感染早期分泌，另一方面，因此，DP96R蛋白有可能是一个很好的保护性抗原。在当前没有可能大规模制备灭活疫苗或弱毒疫苗的情况下，确定一种制备该病毒的免疫原性蛋白的方法，以便研究一种能够预防该疾病的疫苗或具有快速诊断该病毒的试剂对非洲猪瘟的防控将具有重大的意义。

发明内容

为解决现有技术的上述技术问题，本发明提供非洲猪瘟DP96R亚单位蛋白。本发明还提供一种非洲猪瘟DP96R亚单位蛋白的制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种重组的非洲猪瘟病毒DP96R亚单位蛋白，所述重组的非洲猪瘟病毒DP96R亚单位蛋白为非洲猪瘟病毒毒力蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种可在大肠杆菌中表达DP96R蛋白的优化后的OPTI-DP96R的核苷酸序列。为了能够在大肠杆菌中高效表达DP96R蛋白，本发明根据GenBank:FR682468.1上已经存在公开的序列，我们对DP96R基因进行分析，首先对DP96R基因编码的密码子的在原核表达中的密码子偏好性进行了优化，其次对DP96R基因的GC含量和mRNA在大肠杆菌的稳定性进行优化。