[发明专利]一种治疗A型血友病的基因编辑系统及其应用

说明书

本发明提供了一种治疗A型血友病的基因编辑系统及其应用，所述基因编辑系统包括CRISPR‑SaCas9基因编辑载体和F8供体载体；所述CRISPR‑SaCas9基因编辑载体包括串联的SaCas9编码基因和sgRNA，所述sgRNA的靶基因为Alb基因内含子；所述F8供体载体包括截短型F8基因。本发明利用腺相关病毒将SaCas9、sgRNA和BDDF8导入肝细胞，BDDF8通过NHEJ途径定点插入到Alb内含子位点，剪接形成Alb和BDDF8的融合转录本，自断裂多肽促使形成Alb和BDDF8蛋白两种蛋白，F8在小鼠中稳定表达一年，所述基因编辑系统无毒副作用，是潜在的A型血友病治疗药物。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种治疗A型血友病的基因编辑系统及其应用。

背景技术

A型血友病(Hemophilia A，HA)是凝血因子F8基因突变或缺失导致的一类出血性疾病，属于X染色体连锁单基因隐性遗传病。在男性人群中，A型血友病的发病率约为1/5000。根据患者血浆中的F8活性，A型血友病分为轻型(F8活性为正常水平的5％～40％)、中间型(F8活性为正常水平的1％～5％)和重型(F8活性低于正常水平的1％)。轻型和中间型HA患者症状较轻，重型HA患者在关节、软组织等处容易出现自发性或诱发性出血，导致疼痛性、致残性关节炎，同时增加颅内出血和早期死亡的风险。A型血友病的临床表现主要包括关节、肌肉和深部组织出血，以及胃肠道、泌尿道和中枢神经系统出血。若反复出血，不及时治疗可能导致关节畸形和/或假肿瘤形成，严重者可危及生命。

目前，A型血友病的主要治疗方法为替代治疗，即直接向患者输注新鲜全血、血浆或F8浓缩制剂，例如一些发达国家根据医疗标准向HA患者静脉注射外源F8从而预防出血。然而，替代治疗费用昂贵，为患者家庭和国家医保系统带来沉重负担。对于A型血友病等单基因遗传病，基因治疗是实现治愈的唯一途径。

基因治疗是一种以改变基因表达为手段的治疗与预防遗传性疾病和多因素疾病的方法，它通过基因工程的手段，将正常基因(包括调控序列)导入基因突变的患者体内，使导入的基因发挥作用或使突变基因在原位进行校正和修复，从而纠正因基因缺陷导致的各项异常表现。

腺相关病毒(Adeno-associated Virus，AAV)是一种具有单链DNA基因组的小型、非致病性、复制缺陷的细小病毒，具有安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低等优点，在临床基因治疗研究中得到广泛应用。目前靶向肝脏组织的血清型AAV载体主要包括AAV2、AAV5和AAV8。

现有技术鲜有基于腺相关病毒的基因治疗方法应用于A型血友病治疗的方案。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种治疗A型血友病的基因编辑系统及其应用，利用腺相关病毒载体将CRISPR-SaCas9基因编辑系统和F8基因供体递送至F8基因突变或缺失的肝细胞内，实现了F8稳定表达于肝细胞中的效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种基因编辑系统，所述基因编辑系统包括CRISPR-SaCas9基因编辑载体和F8供体载体；

所述CRISPR-SaCas9基因编辑载体包括串联的SaCas9编码基因和sgRNA，所述sgRNA的靶基因为Alb基因内含子；

所述F8供体载体包括截短型F8基因。

本发明中，利用腺相关病毒载体介导SaCas9、靶向Alb基因内含子的sgRNA和F8基因供体导入肝细胞，进行基因编辑，在Alb位点插入无启动子F8表达盒；内源性Alb启动子/增强子在BDDF8处整合和转录后，通过E2A介导的核糖体跳读产生Alb和BDDF8两种蛋白，实现对A型血友病的治疗，原理示意图如图1所示。

优选地，所述sgRNA的靶基因包括Alb基因第11号内含子和/或Alb基因第13号内含子。