[发明专利]一种利用正向调控基因构建高产纤维素酶菌株的方法及应用

说明书

本发明涉及一种利用正向调控基因构建高产纤维素酶菌株的方法及其应用。本发明首先将PpgdA基因和正向调控基因Xyr1基因连接到质粒载体上得到新的重组质粒，所述PpgdA基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述正向调控基因Xyr1基因序列如SEQ ID NO.2所示。再将同时含有PpgdA基因和正向调控基因Xyr1基因的重组质粒转化至相应宿主细胞中制得表达转化体。最后将重组表达转化体转化到里氏木霉中，得到重组菌株。与现有技术相比，本发明通过构建带有强启动子PpgdA的正向调控基因Xyr1的表达元件，将其转化到里氏木霉中，得到一株高产纤维素酶的基因工程菌株，提高了纤维素酶的表达量。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种利用正向调控基因构建高产纤维素酶菌株的方法及应用。

背景技术

随着石油资源日趋短缺、储量日益下降，利用农业秸秆为原料发酵生产燃料乙醇及各种化工产品，以满足人类社会发展需求，被认为是一个可代替石油的清洁化能源来源。专家认为以农作物秸秆为代表的木质纤维素类物质生产乙醇有良好的发展前景，同时有助于解决农业生产废弃物的处理问题，这样不仅缓解了资源危机和粮食危机，对环境污染也有很重要的意义，更为可持续发展提供了保证。

目前，世界各国都在积极研究利用非粮食手段生产生物燃料，用以解决日益严重的能源危机、气候问题以及粮食短缺问题。木质纤维素作为地球上储量最丰富的多糖类物质，利用其生产燃料乙醇已成为各国研究的热点领域。

木质纤维素主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素，以及少量其他组分，例如乙酰基、矿物质和酚醛取代基。根据木质纤维素生物质类型不同，聚合物以不同的聚合度以及不同的组成形成了复杂的三维非均匀结构。经典的理论认为，纤维素降解是在三种纤维素酶组分的协同作用下完成的，内切-1,4-β-葡聚糖酶随机内切纤维素链；外切-1,4-β-葡聚糖酶从纤维素聚合物的还原端或非还原端开始水解；β-葡糖苷酶将内切与外切酶水解形成的纤维二糖，进一步水解为葡萄糖。

然而，木质纤维素类生物质生物转化过程中，纤维素酶生产成本高是制约其产业化应用最主要的瓶颈之一。因此，提高菌株纤维素酶的生产效率，降低生产成本至关重要。

鉴于此，众多研究学者针对如何提高纤维素酶表达量，降低成本方面做了大量的研究。目前，通过基因工程和分子生物学技术提高纤维素酶表达主要有以下几方面的研究：

1、纤维素酶基因的异源表达。Bjorn Alriksson等在黑曲霉中表达Hypocreajecorina内切葡聚糖酶基因Cel7B，以乙醇发酵釜馏物为底物发酵，相对于出发菌株EG酶活显著提高，且黑曲霉还可转化发酵过程中的副产物，包括乙酸，呋喃醛以及酚类物质等乙醇发酵过程中的抑制物[ALRIKSSON B,ROSE S H,VAN ZYL W H,SJODE A,NILVEBRANT N-O,JONSSON L J.Cellulase Production from Spent Lignocellulose Hydrolysates byRecombinant Aspergillus niger[J].Applied and Environmental Microbiology,2009,75(8):2366-74.]。鲁秀婷以glaA强启动子驱动cbhB基因在黑曲霉中表达，使得滤纸酶活提高了1.52倍，CBH酶活提高了1.61 倍[里氏木霉cbh1基因表达载体的构建及在黑曲霉中的表达[D]，山西农业大学， 2014.]；Sujin等在酿酒酵母中，通过表面展示技术分别表达热纤梭菌纤维小体、内切葡聚糖酶，以及来自于里氏木酶的外切葡聚糖酶CBHⅡ和来自于米曲霉的β-糖苷酶BGLⅠ，通过优化不同酵母工程菌的比例，最终使得乙醇产量达到1.8g/L，比原来提高了20％[KIM S,BAEK S H,LEE K,HAHN J S.Cellulosic ethanol production usinga yeast consortium displaying a minicellulosome and beta-glucosidase[J].Microbial Cell Factories,2013,12:7.]。