[发明专利]MALDI-TOF MS微生物鉴定样本生物安全前处理方法

说明书

本发明涉及MALDI‑TOF MS微生物鉴定样本生物安全前处理方法。本发明首先提供一种具有生物安全性的样本制备床和样本制备装置，样本制备床既能够制备微量可供检测的生物安全性样品，也能够制备大体积量的生物安全性样品，制备过程无需离心，整个过程只需要1分钟即可完成。样本制备装置含有本发明的样本制备床，用于制备适用于MALDI‑TOF MS微生物鉴定的样品更加省时省力，并且通量高，极大地满足各级检测机构对具有生物安全风险样品的检测需求，确保操作者的安全、检测设备和环境的安全，降低生物安全风险。

技术领域

本发明涉及MALDI-TOF MS微生物鉴定样本生物安全前处理方法，属于生物医药类微生物检测样品提取装置领域。

背景技术

病原体的快速、准确识别是临床感染诊断、传染病预防控制、食品安全等公共卫生问题的关键因素。随着软电离技术的发展，基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的微生物识别技术也随之问世，该技术是在完整的微生物中添加酸性基质辅助细胞裂解，激光激发细胞裂解物（小蛋白或多肽）形成肽质量指纹谱，与已构建的属、种水平的共性参考谱库进行比对分析，从而实现微生物的鉴定。目前该技术体系已经成熟，其快速、自动化高通量、准确的特性已使其在全球临床诊断、质检、传染病监测、食品安全等领域占有一席之地，并迅速发展。商业化的质谱微生物鉴定系统继布鲁克及岛津公司之后，国内质谱研发及生产厂家正蓬勃发展。为提高公共卫生病原检测能力，我国各级疾控系统均在配备质谱微生物鉴定系统，以提高未知病原快速鉴定能力。微生物鉴定用质谱使用主要包括四个流程：样本制备、点靶、上机检测、数据库检索鉴定。样本制备的优劣直接影响谱图的质量及鉴定成功率。

目前，微生物质谱鉴定样本制备的方法主要有直接涂抹法、扩展直接涂抹法、提取法、以及本发明人前期开发的沉淀涂抹法。（1）直接涂抹法，是将待检测的菌株样本直接涂抹到样本靶上，点上基质溶液后即可上机，该方法快速但鉴定效率低（是提取法的50%-75%），因只靠基质溶液覆盖，存在覆盖不完全的问题，导致病原容易暴露，无法杀死绝大多数病原，具有巨大的生物安全隐患。（2）扩展的直接涂抹法，是在覆盖基质前，先覆盖70%的甲酸溶液，用于辅助细胞破壁裂解，增加鉴定成功率，与直接涂抹法比较鉴定能力略有提高，但溶液成分不能完全杀死病原体，尤其是厚壁、荚膜及芽孢菌，生物安全隐患无法解决。（3）提取法是利用提取液提取病原菌蛋白，鉴定能力非常好，生物安全性也高于涂抹法，但对于厚壁、芽孢等微生物，提取法仍然无法杀灭病原，具有生物安全隐患，极易造成过严重的生物安全事故。（4）沉淀涂抹法更适用于微量病原的质谱鉴定，谱图质量与提取法相当，但生物安全性低于提取法。

目前全球范围内没有用于质谱微生物检测样本生物安全提取的商业化产品。现有技术报道的适用于MALDI-TOF MS方法的待测样本制备过程中，存在生物安全风险，这是由于待鉴定的微生物都是未知微生物，操作者不能根据菌株的外观形态判断该微生物是否是高致病性的，也不能提前预知待测微生物是否带有荚膜或芽孢，只能统一按照一个生物安全等级进行样本前处理，对于厚壁、芽孢等微生物，目前的提取装置无法简便快速杀灭或隔离病原，具有生物安全隐患。假如已知待检测微生物是带有芽孢或荚膜的病原微生物，在提取样品后还需要对可能存在的芽孢或菌体做过滤处理，而能完成过滤芽孢或菌体的装置只有超滤管或滤器。常用的超滤管是密理博公司的产品，价格贵，每个在30元以上，并且该超滤管所需要的样本体积至少要50-100微升，且需要是菌浓度高于10⁸CFU/ml的菌液，对于常规培养出来的单菌落因获得的滤液中蛋白成分达不到质谱的检测限而无法进行鉴定（菌量不足的菌液样品）；而常规的滤器处理的样本体积更大，至少要200微升以上。因此浓度低、体积小的微量的菌液根本无法应用现有技术的方法制得适用于MALDI-TOF MS方法的样本。

为适应和推广微生物质谱鉴定系统在全国范围内的广泛应用，本领域迫切需要一种简便、快速同时又具备生物安全性的处理微生物样品的方法和装置。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有生物安全性的、用于MALDI-TOF MS微生物鉴定样本生物安全前处理方法。