[发明专利]VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法

权利要求书

1.一种VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

获取VacA基因序列，经PCR扩增后构建VacA重组表达载体；

将所述表达载体转化到大肠埃希菌中，经扩增培养后加入诱导剂诱导蛋白表达，获得菌液；

将所述菌液离心后取细菌沉淀物，采用裂解缓冲液对所述细菌沉淀物超声裂解，获得细胞裂解物；将所述细胞裂解物纯化后获得VacA重组蛋白；

将所述VacA重组蛋白采用pH＝2.9的醋酸缓冲液进行透析、复性并保存。

2.根据权利要求1所述的VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法，其特征在于，所述VacA基因序列PCR扩增的条件为：

引物序列为：

F1:5'caatcgttggcggcatcgctacgggtacggctgttggcacggtttcgggcctgcttagttggggactc3'；

F:5'ctttaagaaggagatatacatatgtttttcaccacggttatcattccggcaatcgttggcggcatcgct3'；

反应条件如下：96℃预变性5min；96℃30秒，57℃30秒，72℃1分20秒，72℃5分钟。

3.根据权利要求1所述的VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法，其特征在于，将所述表达载体转化到大肠埃希菌中，经扩增培养后加入诱导剂诱导蛋白表达，获得菌液步骤，具体包括：

将表达载体转化到大肠埃希菌中，涂布K⁺平板，37℃培养过夜，再将单个菌落接种至含有卡那霉素的LB培养基培养过夜，转入含K⁺的LB培养基培养；

当细胞增殖生长曲线在600nm达到OD＝1.2时，加入0.5mM异丙基硫代半乳糖苷诱导剂诱导蛋白表达，获得菌液。

4.根据权利要求1所述的VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法，其特征在于，所述采用裂解缓冲液对所述细菌沉淀物超声裂解，获得细胞裂解物步骤具体包括：

采用裂解缓冲液三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液对所述细菌沉淀物在超声功率为500W，超声3s，间歇3s，超声15min，获得细胞裂解物。

5.根据权利要求1所述的VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法，其特征在于，所述细菌裂解物经离心后获得第一上清液和包涵体沉淀。

6.根据权利要求5所述的VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法，其特征在于，将所述细菌裂解物中的第一上清液进行纯化获得VacA重组蛋白具体包括：

采用Ni-IDA树脂，以裂解缓冲液为柱平衡缓冲液，并以含咪唑的裂解缓冲液进行梯度洗脱，获得VacA重组蛋白。

7.根据权利要求5所述的VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法，其特征在于，将所述细菌裂解物中的包涵体沉淀进行纯化获得VacA重组蛋白具体包括：

将所述包涵体沉淀溶于变性缓冲液并超声裂解，经离心后获得第二上清液，将所述第二上清液采用Ni柱，以变形缓冲液作为柱平衡缓冲液和洗涤缓冲液洗脱杂蛋白，并以含有咪唑的洗涤缓冲液进行洗脱，获得VacA重组蛋白。

8.根据权利要求7所述的VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法，其特征在于，所述变性缓冲液为：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和尿素的复配溶液；所述洗涤缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、尿素、聚氧乙烯单叔辛基苯基醚和氯化钠复配溶液。