[发明专利]VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法

说明书

本发明属于生物医药领域，具体涉及VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法。包括：获取VacA基因序列，经PCR扩增后构建VacA重组表达载体；将所述表达载体转化到大肠埃希菌中，经扩增培养后加入诱导剂诱导蛋白表达，获得菌液；将所述菌液离心后取细菌沉淀物，采用裂解缓冲液对所述细菌沉淀物超声裂解，获得细胞裂解物；将所述细胞裂解物纯化后获得VacA重组蛋白；将所述VacA重组蛋白采用pH＝2.9的醋酸缓冲液进行透析复性并保存，上述制备、复性和保存方法能够获得高活性VacA重组蛋白，能够诱导细胞凋亡。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法。

背景技术

VacA毒素是Hp最重要毒力因子之一，VacA蛋白在慢性胃炎-癌的发病机制中扮演着非常重要的角色。

目前缺乏统一的VacA毒素高效表达体系，使基于VacA结构和功能的基础研究受到阻碍。研究表明，从Hp中提取的天然VacA产量少，工作量大且纯化困难；从Hp分泌上清中收集的VacA毒素粗纯液成分复杂多样，难以解释分析蛋白功能；而传统的VacA重组蛋白多不具有活性，需在体外用HCl激活后才具有生物活性。因此，如何获得高产量且具有生物活性的VacA重组蛋白具有重要的科学意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明成功构建了VacA重组质粒，在大肠埃希菌内诱导表达重组蛋白,所述VacA重组蛋白在pH 2.9的醋酸缓冲液进行复性和保存，且复性保存后的VacA重组蛋白具有促凋亡的生物活性。

基于上述发现，本发明的目的在于提供一种VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

获取VacA基因序列，经PCR扩增后构建VacA重组表达载体；

将所述表达载体转化到大肠埃希菌中，经扩增培养后加入诱导剂诱导蛋白表达，获得菌液；

将所述菌液离心后取细菌沉淀物，采用裂解缓冲液对所述细菌沉淀物超声裂解，获得细胞裂解物；将所述细胞裂解物纯化后获得VacA重组蛋白；

将所述VacA重组蛋白采用pH＝2.9的醋酸缓冲液进行透析、复性并保存。

进一步的，所述VacA基因序列PCR扩增的条件为：

引物序列为：

F1:5'caatcgttggcggcatcgctacgggtacggctgttggcacggtttcgggcctgcttagttggggactc3'；

F:5'ctttaagaaggagatatacatatgtttttcaccacggttatcattccggcaatcgttggcggcatcgct3'；

反应条件如下：96℃预变性5min；96℃30秒，57℃30秒，72℃1分20秒，72℃5分钟。

进一步的，将所述表达载体转化到大肠埃希菌中，经扩增培养后加入诱导剂诱导蛋白表达，获得菌液步骤，具体包括：

将表达载体转化到大肠埃希菌中，涂布K⁺平板，37℃培养过夜，再将单个菌落接种至含有卡那霉素的LB培养基培养过夜，转入含K⁺的LB培养基培养；

当细胞增殖生长曲线在600nm达到OD＝1.2时，加入0.5mM异丙基硫代半乳糖苷诱导剂诱导蛋白表达，获得菌液。

进一步的，所述采用裂解缓冲液对所述细菌沉淀物超声裂解，获得细胞裂解物步骤具体包括：

采用裂解缓冲液三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液对所述细菌沉淀物在超声功率为500W，超声3s，间歇3s，超声15min，获得细胞裂解物。