[发明专利]含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体、人RBP免疫层析检测试剂盒及其制备方法

说明书

本发明涉及一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体、人RBP免疫层析检测试剂盒及其制备方法，所述含氨基或羧基基团物质标记的抗体的制备方法，包括以下步骤：1)将RBP单克隆抗体溶于酸性缓冲液中，之后加入胃蛋白酶进行酶切反应；2)将酶切后的混合溶液使用中性缓冲液透析过夜；3)将得到的液体通过Protein A亲和纯化，DEAE纤维素阴离子交换层析法纯化获得RBP‑F(ab’)₂；4)将得到的液体通过Protein A亲和纯化，DEAE纤维素阴离子交换层析法纯化获得RBP‑F(ab’)₂；5)将得到的抗体中间体与含氨基或羧基基团的物质共价结合，得到含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体。本发明的定向偶联技术能减少补体对检测试剂的影响，降低非特异性结合带来的干扰。

技术领域

本发明属于体外诊断领域，具体涉及一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体、人RBP免疫层析检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

常用的检测用抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，是一种IgG。当抗体结合抗原后，补体与抗体Fc段的补体结合位点结合，对检测试剂造成干扰。此外，Fc段的存在也可能使检测试剂存在假性干扰。

另外，当前的抗体偶联技术多采用共价偶联。由于抗体表面含有丰富的氨基和羧基，这两类基团也是抗体偶联中使用最多的官能团。通常采用的策略是将固相如磁性微球，聚苯乙烯微球或者酶类等表面的羧基用EDC/NHS活化，再与抗体表面氨基形成稳定的酰胺键。极少会采用EDC/NHS对抗体表面的羧基进行活化，因为抗体表面本身带有氨基，容易产生自交联的情况。由于氨基和羧基在抗体表面是普遍存在的，因此这种偶联方法也是随机的。当标记于抗体的互补决定区时，会使抗体失活。即使标记位于Fc段也会因空间位阻的存在造成免疫活性的降低。

视黄醇结合蛋白(Retinol-Binding Protein，RBP)是血液中维生素的转运蛋白，由肝脏合成、广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。测定视黄醇结合蛋白能早期发现肾小管的功能损害，并能灵敏反映肾近曲小管的损害程度，可作为肾功能早期损害和监护治疗的指标，还可作为肝功能早期损害和监护治疗的指标。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体、人RBP免疫层析检测试剂盒及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)将RBP单克隆抗体溶于酸性缓冲液中，之后加入胃蛋白酶进行酶切反应；

2)将步骤1)酶切后的混合溶液使用中性缓冲液透析过夜；

3)步骤2)得到的液体通过Protein A亲和纯化，DEAE纤维素阴离子交换层析法纯化获得RBP-F(ab’)₂；

4)将步骤3)得到的RBP-F(ab’)2与HOOC-(CHCHO)n-NH2共价偶联，形成抗体中间体；

5)将步骤4)得到的抗体中间体与含氨基或羧基基团的物质共价结合，得到含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体。

在本发明的一个具体方案中，其中步骤1)中，所述RBP抗体、胃蛋白酶与酸性缓冲液与的质量比例为(0.5-1)：(0.5-1)：10000，优选为1:1：10000。所述IgG抗体为能与抗原特异性结合的单克隆抗体，能被胃蛋白酶切成F(ab’)2段，且保留结合抗原的活性。

在本发明的一个具体方案中，其中步骤1)中，所述酶切反应的温度为37℃-55℃，优选为37℃，这是酶在37℃时的活性较好；所述酶切反应的时间为0.5-2小时。优选时间为30min，优选时间下，反应程度达到最高，时间再往后，趋于平稳，30min既能充分反应，又能节约试验时间。