[发明专利]一种简单高效的单胞藻分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种简单高效的单胞藻分离纯化方法，本发明通过在光学显微镜下，用血球计数板准确测定待分离纯化藻液的单胞藻细胞密度，再用消毒的沙滤海水将藻液稀释至单胞藻细胞密度为20～30cells/mL，根据待分离纯化藻液中杂藻细胞和敌害生物的数量，吸取1～3滴经稀释的藻液滴入装有单胞藻培养液的玻璃试管中，在光照充足且没有阳光直射的地方培养10～15天，经过镜检，筛选得到纯化的、无杂藻细胞和敌害生物的单胞藻。本发明的方法操作简单，对操作人员的专业度要求极低，适用场所广泛，既适合条件良好的实验室又适合条件简陋的养殖场，且分离纯化成功率达到100％，可保证单胞藻纯种培养、长期保存。

技术领域

本发明涉及单胞藻养殖领域，具体地，涉及一种简单高效的单胞藻分离纯化方法。

背景技术

作为饵料的单胞藻在经济养殖品种种苗培育中得到广泛应用，但单胞藻保种及接种过程中经常发生杂藻细胞或敌害生物污染的现象，导致单胞藻不能正常生长和死亡，因此，需要对藻种进行分离纯化以保证单种培养和正常生长繁殖，才可适用于扩大规模的生产性培养。

传统的单胞藻分离纯化方法主要是水滴法和平板分离法。水滴法中，用毛细吸管吸取稀释后的藻液，在载波片上分散地滴4～5个微水滴，再在显微镜下镜检每个微水滴中单胞藻细胞、敌害生物和杂藻细胞的情况，将有单胞藻细胞、无敌害生物和杂藻细胞的微水滴用微吸管吸取并移入到装有培养液的试管中培养，但水滴法存在以下三点不足：(1)为了保证每个水滴中只有一个细胞，藻液要先进行适当稀释，稀释的程度需要根据微水滴中藻细胞数量不断调整，操作繁琐，过程较长；(2)由于该方法中水分易蒸发，微水滴盐度剧烈升高，导致单胞藻细胞易收缩变形甚至死亡，降低了成功率；(3)不能保证微水滴中的单胞藻细胞被微吸管准确吸取，可能还残留在载玻片上，进一步降低了成功率。基于此，专利CN107384794A对水滴法进行了进一步改进，将每滴水样单独滴在一个可直接放入培养试管中的小规格承载片上，经镜检挑选后，将选中的所述承载片直接放入所述培养试管中进行培养，该专利的方法弥补了上述第三点不足，但仍存在前两点不足。此外，单胞藻的另一种分离纯化方法——平板分离法中，用接种环蘸取藻液轻轻在含有单胞藻营养盐的琼脂培养基上划线，使藻细胞在线上连续稀释，单个单胞藻细胞生长繁殖成单胞藻细胞群落后，置于试管中培养，然而平板的制备过程比较麻烦，且琼脂培养基中的水分易在长达10～15天的分离纯化过程中蒸发变干，导致单胞藻细胞收缩变形甚至死亡。

可见，现有的单胞藻分离纯化方法成功率极低，而且仅能在良好的实验室条件下进行，难以在条件简陋的养殖场开展，分离纯化后的单胞藻也难以长期保存，因此，开发一种操作简单，纯化成功率高，适用场所广泛的单胞藻分离纯化方法对于单胞藻养殖领域具有相当的必要性。

发明内容

本发明旨在克服现有单胞藻分离纯化方法的不足，提供一种简单高效的单胞藻分离纯化方法，本发明的方法操作简单，对操作人员的专业度要求极低，适用场所广泛，既适合条件良好的实验室又适合条件简陋的养殖场，且分离纯化成功率达到100％，可保证单胞藻纯种培养、长期保存。

因此，本发明的第一个目的是提供一种简单高效的单胞藻分离纯化方法。

本发明的另一目的是提供上述方法在分离纯化海水单胞藻方面的应用。

为实现上述目的，本发明是通过以下方案实现的：

本发明提供了一种简单高效的单胞藻分离纯化方法，包括以下步骤：

S1.培养液配制：在沙滤海水中加入硝酸钠、磷酸二氢钾、硅酸钠、柠檬酸铁，使其浓度分别为30×10^-6～50×10^-6mg/L、3×10^-6～5×10^-6mg/L、1×10^-6～2×10^-6mg/L、0.1×10^-6～0.2×10^-6mg/L，制成培养液；