[发明专利]一种PTCH1基因缺失间充质干细胞的建立方法

权利要求书

1.一种PTCH1基因缺失间充质干细胞的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，根据PTCH1基因序列，设计sgRNA序列；

步骤2，sgRNA活性检测，确定最优sgRNA，最优sgRNA序列为GAGCTGTGGGTGGAAGTTGG，具体步骤包括：

a.将寡核苷酸双链连接到pX330载体上，再将连接产物转化至E coli DH5α感受态细胞中，扩大培养，提取质粒；

b.将之前构建好的sgRNA与Cas9共表达的22个载体分别转染至293T细胞中；

c.以b步骤中的细胞裂解后的产物为模板，用设计好的引物进行PCR；

d.酶切步骤c中的PCR产物；

e.通过是否有切开后的相对小的两条目的条带以及被切开的条带所占的比例选择切割效率最高的sgRNA；

步骤3，将步骤2中切割效率最高的sgRNA和嘌呤霉素抗性的PGK-puro质粒电转到骨髓间充质干细胞；

步骤4，基因敲除验证；

步骤5，将基因敲除质粒进行测序。

2.根据权利要求1所述的一种PTCH1基因缺失间充质干细胞的建立方法，其特征在于，步骤2中PCR引物序列为PrimerF:CGATACAAGGCTGTTAGAGA，PrimerR:CCTATTGGCGTTACTATTGAC。

3.根据权利要求1所述的一种PTCH1基因缺失间充质干细胞的建立方法，其特征在于，步骤2中PCR反应体系为2×Phanta Max Buffer 25μL，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL，dNTP Mix 1μL，PrimersF 2μL，PrimersR 2μL。

4.根据权利要求1所述的一种PTCH1基因缺失间充质干细胞的建立方法，其特征在于，使用T7核酸内切酶Ⅰ进行酶切验证。

5.根据权利要求1所述的一种PTCH1基因缺失间充质干细胞的应用，其特征在于，所述的PTCH1基因缺失间充质干细胞，用于筛选促成骨形成药物。

6.根据权利要求1所述的一种PTCH1基因缺失间充质干细胞的应用，其特征在于，所述的PTCH1基因缺失间充质干细胞，用于筛选促软骨形成药物。