[发明专利]一种PTCH1基因缺失间充质干细胞的建立方法

说明书

本发明涉及一种PTCH1基因缺失间充质干细胞的建立方法，具体步骤包括：步骤1，根据PTCH1基因序列，设计sgRNA序列；步骤2，sgRNA活性检测，确定最优sgRNA，最优sgRNA序列为GAGCTGTGGGTGGAAGTTGG；步骤3，将步骤2中切割效率最高的sgRNA和嘌呤霉素抗性的PGK‑puro质粒电转到骨髓间充质干细胞；步骤4，基因敲除验证；步骤5，将基因敲除质粒进行测序，本发明构建的PTCH1基因缺失间充质干细胞，可用于筛选促成骨形成药物。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种PTCH1基因缺失间充质干细胞的建立方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）为一种多能干细胞，其自身具有极强的自我更新能力和分化潜能，在体外培养可向成骨和软骨分化。

Hedgehog（Hh）信号通路是调控个体发育过程中的重要通路，其在软骨内骨化过程中通过Indian Hedgedog(IHH)调控成骨细胞分化，对成骨细胞的形成起着不可或缺的作用。IHH结合功能性跨膜蛋白受体Patched后通过跨膜蛋白Smoothened(SMO)激活信号通道，抑制蛋白水解切割的GLI3^R阻遏物的产生并促进全长GLI2激活物的产生，促进RUNX2⁺OSX⁺细胞形成，从而刺激成骨细胞分化。

将骨髓间充质干细胞的PTCH1基因缺失，可以抑制其向成骨细胞分化，利用此模型，可以筛选促成骨形成药物。

发明内容

本发明的目的是建立PTCH1基因缺失的间充质干细胞。

本发明的制备过程如下：

本发明提供一种基因打靶试剂盒，所述试剂盒包括两条Oligo序列，

其序列为5’-ACACCGAGCTGTGGGTGGAAGTTGGG-3’，

5’-AAAACCCAACTTCCACCCACAGCTCG-3’，使用该试剂盒可以用于PTCH1基因表达的沉默。

进一步的，本发明提供一种PTCH1基因缺失间充质干细胞的建立方法，所述制备方法包括：

步骤1，根据PTCH1基因序列，设计sgRNA序列；

在NCBI上查询人PTCH1基因序列（NM_001083604.3，序列表序列1），根据CRISPR/Cas9敲除原理，在http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx上设计PTCH1靶位点；

步骤2，sgRNA活性检测，确定最优sgRNA；